基于干种子DNA的洋葱杂交种纯度分子标记快速鉴定

孙亚玲 李艳伟 王振宝 吴雄 刘冰江 杨妍妍

关键词：洋葱；种子；DNA提取；纯度；快速鉴定

洋葱（Allium cepaL．）属于石蒜科（Amarylli-daceae）葱属（Allium）二年生草本植物，栽培历史悠久，适应性强，在我国种植范围较广。随着分子生物学的快速发展，采用分子标记技术与传统育种相结合的方法开展洋葱分子育种研究已成为趋势。DNA提取是分子技术实施的基础环节，DNA制备质量对于后续实验开展的效率及准确率尤为重要。传统的植物总DNA提取方法有CTAB法、SDS法和高盐低pH法等，国内外生物公司还开发了多种商品化快捷型的DNA提取试剂盒。但由于不同植物中次生代谢产物的种类和含量存在较大差异，即使同种植物不同组织的次生代谢产物和含量也不尽相同，使得对某种植物组织优化的DNA提取方法不一定适用于其他材料。

目前已成功从植物叶、茎、根、幼苗、组培苗、愈伤组织、果实等组织或器官中提取到DNA，而干燥种子的DNA与组蛋白紧密结合，导致提取的DNA丰度低、质量不高，加大了从含有大量蛋白质、多糖类物质的干种子中提取高质量DNA的难度。关于从种子中提取DNA的实验方法国内外已有报道，如：Chunwongse等发明了从水稻和小麦的半粒种子中提取DNA的方法：McDo-nald、Kang等发明了从玉米、棉花、小麦、花生、大豆等作物种子中提取DNA的方法：国内研究者也相继发明了从不同作物干种子中提取DNA的方法，并取得了较好的效果。但关于洋葱干种子DNA提取方法尚未见报道。鉴于此，本研究以洋葱干种子为试材，考虑到种子中含有蛋白质、脂肪和多糖等，采用全式金PlantZol试剂盒、天根快捷型植物基因组DNA提取系统、TPS法和CTAB法提取洋葱干种子及不同发芽天数种子的基因组总DNA。同时对种子用量进行筛选，通过比较提取的DNA质量，确定了一种能够从洋葱干种子中提取高质量DNA的方法，并用于对杂交种Ms位点基因型的SCAR标记鉴定，以期建立一种基于干种子DNA的洋葱杂交种纯度鉴定体系，为快速准确地鉴定杂交种的纯度及进行种质资源的遗传多样性分析等工作奠定基础。

1材料与方法

1.1试验材料

本研究选用黄皮洋葱杂交种‘天正105、紫皮洋葱杂交种‘紫铃及其父母本的种子，均由山东省农业科学院蔬菜研究所洋葱课题组提供。

1.2DNA提取方法

1.2.1PlantZol试剂盒法参照北京全式金生物技术有限公司PlantZol（EE141 -01）试剂盒说明书对3粒‘紫铃干种子进行DNA提取。

1.2.2快捷型植物基因组DNA提取系统法参照天根生化科技（北京）有限公司快捷型植物基因组DNA提取系统（DP321非离心柱型）说明书对3粒‘紫铃干种子进行DNA提取。

1.2.3TPS法将3粒‘紫铃干种子放人2.0mL离心管中，加入钢珠，在组织破碎仪中破碎2min；加人800uL TPS缓冲液禾口5uL RNase，涡旋振荡1min，80℃水浴加热30min，期间颠倒混匀2～3次；12000r/min离心5min，取上清液至新的1.5mL无菌离心管中，加入等体积的异丙醇，再12000r/min离心5min，沉淀用70%乙醇洗2次，彻底晾干；加入20uL无菌ddH20溶解DNA沉淀，-20℃冻存备用。

1.2.4CTAB法分别将1、2、3、4、5粒‘紫铃干种子及其发芽3、5、7、9d的种子放人2.0 mL离心管中，加入钢珠，在组织破碎儀中破碎2min;加入1mL65℃预热的CTAB提取液和5uLRNase，涡旋振荡1min，65℃恒温水浴30min，期间颠倒混匀2～3次，12000r/min离心5min，吸取上清液至新的2.0mL无菌离心管中，用DNA提取液（25：24：1）抽提1次，12000r/min离心5min，吸取上清液至新的1.5mL无菌离心管中，加入等体积的异丙醇，充分混匀，12000r/min离心5min，弃上清，沉淀用70%乙醇漂洗2次，彻底晾干：加入20uL无菌ddH20溶解DNA沉淀，-20℃冻存备用。

1.3基因组总DNA的质量检测

基因组总DNA的质量主要用DNA的完整性、纯度和浓度来衡量。分别采用1.0%的琼脂糖凝胶电泳、Nano Photometer超微量分光光度计仪（IMPLEN，P-Class P330）对提取的总DNA进行质量检测。

1.4基于SCAR标记的洋葱杂交种纯度鉴定

利用本课题组开发的洋葱细胞核雄性不育分子标记SCAR（ sequence characterized amplified re-gions．特定序列扩增）进行PCR扩增，用于洋葱杂交种的纯度鉴定。所用引物（表1）由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。PCR反应体系：94℃预变性5 min；94℃变性30 s，60℃退火45s，72℃延伸2min，35个循环；72℃后延伸10min，4℃保存。反应结束后，PCR产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳检测。

2结果与分析

2.1洋葱干种子基因组总DNA提取方法的比较分析

采用全式金PlantZol试剂盒、天根快捷型植物基因组DNA提取系统、TPS法和CTAB法分别提取洋葱干种子的基因组总DNA，经1.0%琼脂糖凝胶电泳检测。结果（图1）显示，除天根快捷型植物基因组DNA提取系统未出现相应的DNA电泳条带外，其他3种方法均可得到完整的DNA条带。但全式金PlantZol试剂盒和TPS法提取的基因组总DNA带型呈锯齿状，在点样孔处有明显的残留物质，其中TPS法的点样孔处残留物质尤其多；CTAB法提取的基因组总DNA带型整齐一致、单一明亮，条带无拖尾和降解现象，也没有明显的RNA和蛋白污染。

采用超微量分光光度计对所提取DNA的完整性和纯度进行检测，每种提取方法获得的DNA样本均进行3次重复。结果（表2）显示，CTAB法提取的DNA浓度和纯度均最好，天根快捷型植物基因组DNA提取系统提取的DNA浓度和纯度最差，这与琼脂糖凝胶电泳结果一致。

综上所述，CTAB法是提取洋葱干种子DNA的最佳方法，用该方法进行后续试验。

2.2不同粒数洋葱干种子基因组总DNA提取质量的比较

分别选取1、2、3、4、5粒洋葱干种子，采用CTAB法进行基因组总DNA的提取。对提取DNA的质量检测（图2和表3）发现，不同粒数洋葱干种子均能获得完整的基因组DNA，且DNA浓度随着种子粒数的增加逐渐升高。用1粒和2粒洋葱干种子提取的基因组DNA条带虽然较弱，但带型整齐，无拖尾现象，点样孔处无明显的残留物质，OD260/OD280分别为1.807和1.809；用3、4、5粒种子得到的DNA条带虽然明亮，但带型不整齐，呈锯齿状，点样孔处也越来越亮，OD260/OD280分别为1.701、1.652、1.528，说明存在多糖和蛋白等杂质污染。总体来说，基因组DNA的浓度与种子数量呈正相关，而DNA质量以1～2粒种子的较好。

2.3洋葱干种子及不同发芽天数种子基因组总DNA提取质量的比较

分别选取干种子及发芽3、5、7、9d的洋葱种子，采用CTAB法进行基因组总DNA的提取。对提取DNA的质量检测结果（图3和表4）表明，洋葱干种子及不同发芽天数的种子均能提取到带型整齐、无弥散现象的基因组DNA。发芽种子的DNA浓度均明显高于干种子，且随着发芽天数的增加，DNA浓度越来越高，分别是干种子的1.53～4.01倍，发芽第9天种子的DNA浓度达到262.1ng/uL。但是发芽第5、7、9天的种子提取的DNA点样孔处有轻微的蛋白残留，而干种子和发芽第3天的种子提取的DNA条带单一清晰，点样孔处干净无杂质，OD260/OD280分别为1.836和1.837，说明洋葱干种子和发芽第3天的种子提取的基因组总DNA更加完整，纯度更高。

2.4基于SCAR标记的洋葱杂交种纯度鉴定

经过上述试验，最终确定CTAB法提取1粒洋葱干种子DNA的效果最好，用该方法进行洋葱杂交种纯度鉴定。以洋葱杂交种干种子的DNA为模板，利用SCAR分子标记进行DNA提取质量的检测，同时对Ms位点基因型做出判断。结果（图4）显示扩增出898 bp和621 bp两条清晰明亮的条带，说明检测种子的Ms位点基因型为杂合的Msms，是真实的杂交种。表明用CTAB法从1粒洋葱干种子中提取的DNA完全可以满足杂交种分子标记鉴定的要求。

利用SCAR分子标记对本课题组选育的洋葱杂交种纯度进行鉴定。随机选择当年收获的洋葱杂交种‘天正105和‘紫铃的种子各150粒，采用CTAB法提取DNA，分别以两个杂交种的父、母本作对照进行PCR扩增。结果显示所检测的洋葱种子DNA均同时具有父、母本的特异性条带（图5），说明检测的种子是真正的杂交种，品种纯度为100%。可见，用本研究确定的方法提取的洋葱干种子DNA质量好，用其基于SCAR分子标记检测洋葱细胞质基因型，能实现杂交种纯度的早期鉴定。

3讨论与结论

关于植物种子DNA最优提取方法的筛选，前人研究多以甜瓜、玉米、大豆、小麦等作物为主，对于葱属植物基因组DNA提取方法的研究较少。本研究对全式金PlantZol试剂盒、天根快捷型植物基因组DNA提取系统、TPS法和CTAB法4种方法提取的洋葱种子DNA质量进行了比较，对不同发芽天数种子及得到有效DNA的种子用量进行了优化筛选，经过凝胶电泳分析和分光光度计检测，结果表明CTAB法提取的洋葱干种子基因组总DNA质量最好，这与水稻、小麥、玉米等作物种子基因组总DNA提取效果的研究一致。同时，我们通过研究不同粒数（1～5粒）洋葱干种子DNA提取效果，发现种子粒数越多，相应的杂质也越多，这可能是由于提取时混有大量种皮且洋葱富含多糖多酚的缘故。

随着分子生物学技术的发展，基于DNA多态性的分子标记正逐渐成为作物杂交种纯度鉴定的有力工具。通过分子标记鉴定杂交种纯度，可以大大缩短鉴定周期，且操作简单，是一种更直接且准确高效的方法。洋葱DNA的有效提取是分子标记鉴定杂交种纯度的前提和基础，也是较为关键的步骤。目前，关于植物基因组DNA提取方法已有大量报道，但大多是以叶片作为DNA的提取材料，需要在播种后25～30d的苗期才能进行DNA提取操作，所需周期较长。本研究利用干种子作为提取材料，不经过苗期阶段，在获得杂交种种子后采用1粒洋葱干种子即可获得有效DNA，并利用SCAR分子标记对杂交种纯度进行鉴定，不但降低了种子消耗成本，还实现了杂交种纯度的早期鉴定。

洋葱杂交种生产主要是利用“三系”法，即细胞质雄性不育系、保持系和父本自交系配套的杂交制种技术。一般情况下，亲本纯合性越高，杂交种的优势越强。利用基因型为S（msms）的不育系为母本，与基因型为N/S（MsMs）的父本自交系杂交生产杂交种子，杂交种的基因型通常为S（Msms）。洋葱杂交种商品化生产过程中，父本拔除不彻底、隔离措施不当或者机械混杂等均有可能导致杂交种纯度降低。而杂交种的遗传真实性是种子质量的重要标志之一，种子纯度是衡量种子质量优劣的核心指标，直接影响洋葱的产量、商品性和品质。因此，随着洋葱杂交种的广泛应用和种业市场的日趋成熟，种子纯度快速检验的重要性越来越突出。目前，AFLP、SSR、SRAP、In-Del、SNP等分子标记技术已被广泛应用于瓠瓜、茄子、大白菜、甜瓜、黄瓜及辣椒等蔬菜的杂交种纯度鉴定中。本研究利用SCAR分子标记对杂交种Ms位点的基因型做出判断，进行洋葱杂交种的纯度鉴定。采用CTAB法从1粒洋葱干种子中提取的DNA可以扩增出清晰明亮的条带，根据条带的迁移位置可以清楚区分洋葱不同细胞核基因型之间的差异。PCR扩增结果显示所检测的洋葱种子DNA均能扩增出898 bp和621bp两个片段，说明检测种子Ms位点的基因型为杂合的Msms，是真实的杂交种。

本研究确定了CTAB法为洋葱干种子基因组总DNA提取的最佳方法，以1粒洋葱干种子获得的有效DNA完全可以满足杂交种分子标记鉴定的要求，且利用SCAR分子标记技术鉴定洋葱杂交种的纯度，大大提高了检测效率，具有广泛的应用前景和利用价值。