金银花外观性状与主要有效成分含量的相关性研究

唐志强 程雪梅 刘谦 李佳 刘振华 张永清 刘红燕 蒲高斌

关键词：金银花；外观性状：有效成分：相关性分析

金银花为忍冬科植物忍冬（Lonicerae japonzcaThunb.）的干燥花蕾及初开的花，是我国传统大宗中药材之一，具有清热解毒、疏散风热等功效，被广泛应用于中药临床及中成药复方制剂。金银花主产于山东、河南、河北等地，主要有效成分为黄酮类、有机酸类及萜类等，其中木犀草苷和绿原酸类化合物是2020版《中华人民共和国药典》规定的金银花指标性成分。

中药材质量一直是制约中医临床合理用药的瓶颈问题之一．传统的依靠经验通过药材外观进行品质鉴别，即所谓的“辨状论质”，目前仍是中药材真伪优劣鉴别的主要方法。如细辛以色白者为善；知母以根黄白、脂润者为好；黄芪以大而肥润箭直者良。然而，“辨状论质”主要依靠专家经验，受人为主观因素及判别标准等的影响，很难形成统一、客观的标准。如何解析“辨状论质”背后的科学道理成为中药现代化发展亟需解决的问题。为此，有学者从外观性状与有效成分间相关性的角度对中药材“辨状论质”的科学性进行探讨，已在多个物种中得到验证，但尚未见金银花的相关研究。因此，本试验选用颜色、花蕾直径和长度等金银花外观指标，分析其与金银花主要有效成分（木犀草苷和绿原酸类物质）含量之间的相关性，以期为金银花“优形”“优质”研究提供新思路，进而为金银花药材质量标准制定提供参考依据。

1材料与方法

1.1试验材料与试剂

供试的50批金银花于2022年3月分别收集于山东、河南和河北三省份，经山东中医药大学蒲高斌教授鉴定，为忍冬科多年生木质藤本植物忍冬（Lonicerae japonica Thunb.）的花蕾。

木犀草苷（批号Y13JIOH93050）、绿原酸（批号20130415）、异绿原酸A（批号20130816）、异绿原酸C（批号20130924）对照品均由上海源叶生物科技有限公司提供，质量分数均大于98%。乙腈、甲酸为色谱纯，其他试剂为分析纯。

1.2调查项目及方法

1.2.1金银花颜色值测定每批金银花随机抽取10个完整花蕾，用CM-600D型色差仪（杭州柯盛行仪器有限公司）进行扫描，使用光源为D65，照明口径为50mm，波长扫描范围为380～780nm，标准观察角度为10°，扫描速度为600nm/min。所测数据用色空间法表示，其中，L*为亮度值，值越大表示亮度越高；a表征红一绿色轴，正值为红，负值为绿；b表征黄-蓝色轴，正值为黄，负值为蓝。以标准白板作为标准样品，测得L*=17.53，a=13.76，b=45.64。将所测得的金银花样品色度值与标准样品的测定值做差，即为样品的色度值；其中，Aa值越大样品颜色越红，反之越绿，而Ab值越大样品颜色越黄，反之越蓝。每个花蕾扫描10次，取平均值。

1.2.2花蕾外观性状测量每批金银花随机抽取10个完整花蕾，用游标卡尺分别测量其长度及上、中、下部直径，取平均值。

1.2.3金银花有效成分含量的测定使用Agi-lent 1260高效液相色谱仪进行测定。

混合对照品溶液的制备：精密称取绿原酸、木犀草苷、异绿原酸A和异绿原酸C对照品适量，用50%的甲醇制成单个对照品储备液，分别精密量取各储备液适量，配制成系列浓度的混合对照品溶液。

供试品溶液的制备：精密称取金银花样品粉末（过3号筛）1.0g，置100mL具塞锥形瓶中，精密加入50%甲醇50mL，密塞，称重，超声处理（100W，100kHz） 30min，放冷，用50%甲醇补足失重，摇匀，4000r/min离心10min，取上清，过0.22um微孔滤膜，即得供试品溶液。

色谱条件：色谱柱ZORBAXSB-C18（250mmx4.6mm．5um）；流速1.0mL/min；柱温30℃；进样量20uL；检测波长327、350nm。流动相A为0.1%甲酸溶液，B为乙腈。洗脱梯度：0～10min，8%～10%B;10～20min，10%～15%B;20～30min，15%B;30～40min， 15%～25%B;40～60min，25%～100%B。

1.3数据处理与分析

采用SPSS 22.0軟件对金银花外观性状指标及有效成分含量进行Pearson双侧相关性统计分析，并进行逐步回归分析。

2结果与分析

2.1不同批次金银花颜色差异分析

为减小误差，每批金银花随机选10个花蕾进行颜色值测定，然后取平均值，结果如表1所示，相对标准偏差（RSD）均<3%。50批次金银花的AL*均为正值，说明花蕾亮度比较大；其中，山东13个批次金银花除山东007的AL*值仅为4.86外，其他的AL*值均在10.15～18.65范围内；河南21批次金银花的AL*值大多在10.00左右，仅河南01 1较低，为2.80;河北16批次的金银花除河北003（4.94）、河北006（2.88）、河北010（5.59）外，AL*值均大于10.00。50批次的金银花中绝大多数的Aa*、△b为负值，说明花蕾颜色偏绿、偏蓝；仅河北010的Aa*、△b值为正，山东007的Ab*值为正，说明这两批次金银花均偏黄，河北010金银花偏红。

2.2不同批次金银花花蕾形态指标的差异分析

由表2可见，50批次金银花的花蕾上、中、下部直径分别分布在2.12～3.70、0.96～1.62、0.66～1.03mm，均表现为上部直径>中部直径>下部直径，其中山东010金银花的花蕾上部直径最大，河北001金银花的花蕾中、下部直径最大。50批次金银花的花蕾长度均在17.65～31.40mm范围内，大多25mm左右，其中，河南009批次的金银花最长，河南001批次的金银花最短。

2.3不同批次金银花的有效成分含量测定及差异分析

2.3.1线性关系考察在1.2.3中的方法条件下，各成分分离度良好（图1）。分别吸取不同体积的混合对照品溶液，用50%的甲醇稀释至10mL，制成10个质量浓度梯度的系列溶液进行高效液相色谱（HPLC）测定，以对照品的质量浓度为横坐标、峰面积为纵坐标进行线性回归分析，结果（表3）显示，四种有效成分均存在线性区间，R2值达到0.9997～0.9999，線性关系良好。

2.3.2方法学考察（1）精密度试验：精密吸取混合对照品溶液，按照上述色谱条件分别进行日内精密度考察（1天内连续分析5次）和日间精密度考察（每3天分析一次）。结果显示，两种考察方法下，4种有效成分峰面积的RSD均<1.5%，表明仪器精密度良好。

（2）重复性试验：取同一供试品各1.0g，平行制备6份供试品溶液，进行HPLC分析，结果显示各成分峰面积RSD在0.38%～0.96%，表明方法重复性良好。

（3）稳定性试验：取金银花供试品溶液，分别于0、2、4、6、8、12、24 h进行HPLC分析，4种成分峰面积的RSD在0.86%～1.78%，表明供试品溶液在24h内稳定性良好。

（4）加样回收率试验：精密称取已知成分含量的金银花供试品6份，分别加入一定量的对照品，进行HPLC分析，结果显示，各成分平均加样回收率为98.78%～103.66%，符合要求。

2.3.3有效成分含量测定由表4可见，河北001金银花的绿原酸含量最高，为4.31%；有3批金银花的绿原酸含量低于1.50%，其中河北010金银花的最低，为0.58%。河北003金银花的异绿原酸A和异绿原酸C含量最高，分别为2.12%和0.42%：河北010金银花的异绿原酸A和异绿原酸C含量最低，分别为0.30%和0.05%。3种绿原酸类物质总量最高的是河北003金银花，为6.49%：有18批次金银花的3种绿原酸类物质总量低于3.80%，其中河北010的最低，为0.93%。

2.4金银花外观性状与主要有效成分的相关性分析

如表5所示，AL*与绿原酸含量极显著负相关，与木犀草苷含量极显著正相关，与3种绿原酸物质总量显著负相关；△a、Ab、花蕾上部直径与异绿原酸A和C含量及3种绿原酸物质总量均呈极显著负相关；花蕾中、下部直径与木犀草苷含量呈极显著正相关，与3种绿原酸物质总量显著正相关：花蕾长度与木犀草苷含量和3种绿原酸物质总量极显著负相关，与异绿原酸A显著相关。

在相关性分析基础上建立各有效成分含量与金银花外观性状的线性回归模型，并进行统计分析，结果见表6。以AL为自变量X，以绿原酸含量为因变量Y，建立回归方程Y=10.481-0.536X，验证其显著性的F值和P值分别为6.820和0.009，达极显著水平；以Aa*、△b、花蕾上部直径、长度为自变量，以异绿原酸A含量为因变量，建立回归方程Y=0.722-0.093Aa-0.007Ab-0.097X上部直径+0.012X长度，其F值和P值分别为50.043和0.000，达极显著水平；以Aa、Ab、花蕾上部直径为自变量，以异绿原酸C含量为因变量，建立回归方程Y=0.158-0.005Aa*-0．001△b-0.008X上部直径，其F值和P值分别为17.286和0.000，达极显著水平；以AL*、Aa*、Ab*及花蕾上、中、下部直径为自变量，以3种绿原酸物质总量为因变量，建立回归方程Y= 2.553-0.027AL-0.316Aa-0.024Ab-0.144X上部直径+0.179X+0.40IX下部直径，其F值和P值分别为54.445和0.000，达极显著水平；以AL*、Aa*、中部直径、下部直径、花蕾长度为自变量，以木犀草苷含量为因变量，建立回归方程Y=0.041+其F值和P值分别为36.189和0.000，达极显著水平。

3讨论与结论

目前对中药材质量的评价方法多以主观描述为主，因此外观性状是判断药材质量等级和预测活性成分含量的重要依据。如巴戟天、红花和甘草等可以通过色泽、大小、直径等外在指标判断药材品质和有效成分含量。本研究对50批次金银花药材“形”与“质”的关系进行了初步探索，结果发现，金银花中绿原酸含量与AL*值具有显著负相关性，亮度越大，绿原酸含量越低：异绿原酸A和C的含量及3种绿原酸物质总量均与Aa*、Ab*、花蕾上部直径极显著负相关，3种绿原酸物质总量还与AL*和花蕾长度显著负相关，而与花蕾中、下部直径显著正相关，说明花蕾颜色偏绿、偏蓝、上部直径偏小的金银花药材含有较多异绿原酸A、异绿原酸C，3种绿原酸物质总量较高，这与王玲娜等的研究结果一致；木犀草苷含量与AL*和花蕾中、下部直径呈极显著正相关，而与Aa*和花蕾长度呈极显著负相关，说明花蕾偏绿、偏亮、中下部直径偏粗的金银花药材木犀草苷含量较高。上述结论使得借助信息化技术搭建金银花人工智能鉴别平台成为可能，从而实现短时间、低成本、高精度鉴定，为建立金银花品质快速鉴别和评价体系奠定基础，从而有效解决传统中药材鉴别人才流失和不足的问题。

在金银花药材形成过程中，色素积累是导致其色泽发生改变的主要原因。植物体内色素的积累和代谢受基因型、代谢途径、气候条件等多种因素的影响。今后可围绕金银花色素合成基因的克隆、表达模式、功能鉴定、调控网络等方面展开研究，以从分子层面揭示金银花外观性状与有效成分的相关性，为制定金银花药材质量标准奠定基础。