靛蓝提取物中靛蓝和靛玉红的分析方法比较

王成章, 颜洋洋,2, 周 昊, 刘丹阳, 商士斌, 张华兴

(1.中国林业科学研究院 林产化学工业研究所;江苏省生物质能源与材料重点实验室;国家林业和草原局林产化学工程重点实验室;林木生物质低碳高效利用国家工程研究中心,江苏 南京 210042; 2.南京林业大学 江苏省林业资源高效加工利用协同创新中心,江苏 南京 210037; 3.凯里小生物科技有限公司,贵州 凯里 556000)

植物靛蓝提取物(新型青黛)由马蓝、木兰、蓼蓝或菘蓝的茎叶发酵后加工制得[1],富含吲哚生物碱类、核苷类、甾醇类和酚类化合物等物质,主要药效成分为靛蓝和靛玉红,具有抗氧化、抗菌、消炎、抗病毒、抗癌等多种生物活性[2-3]。靛蓝提取物近年来常用于调配复方中药和治疗疾病,具有清热解毒、抗炎止血、抗衰老、抗癌等作用[4-6]。由于原料和加工工艺的不同,靛蓝提取物化学成分种类和含量存在差异[7-8]。《中华人民共和国药典》[9-10]中关于靛蓝含量分析方法有高锰酸钾法、分光光度法、紫外分光光度法、高效液相色谱法;靛玉红含量分析方法有薄层色谱法、高效液相色谱法。此外,文献[11-16]还报道了双波长紫外分光光度法、磺化-紫外分光光度法、一阶导数紫外分光光度法、单扫描极谱法、循环伏安法等植物靛蓝提取物的分析检测方法。因此,为了筛选出合适的测定靛蓝提取物中靛蓝、靛玉红含量方法,本研究采用盐酸酸化、葡萄糖还原和乙酸乙酯提取纯化分离得到3种靛蓝提取物,选用高效液相色谱法、紫外可见分光光度法和双波长紫外分光光度法3种常用的植物靛蓝提取物的分析检测方法对提取物进行测定,通过方法学考察与统计学分析,比较3种分析方法对3种靛蓝提取物测定的差异性,并确定不同样品的最佳分析方法,以期为不同靛蓝含量提取物的快速测定提供依据。

1 材料与方法

1.1 原料、试剂与仪器

靛蓝膏(含水量50%～60%)由贵州小生源有限公司提供,经80 ℃烘箱烘干12 h,过0.18 mm筛,制得靛蓝粗提物(含水8.42%,靛蓝2%～5%,靛玉红0.034%,质量分数,下同),备用。靛蓝和靛玉红标准品(HPLC≥98%)、甲醇(色谱纯)均购于阿拉丁生化试剂有限公司;乙酸乙酯、氢氧化钠、葡萄糖、N,N-二甲基甲酰胺(DMF)均为分析纯,购于国药集团化学试剂有限公司;盐酸(化学纯),购于南京化学试剂有限公司。

CBM-10A VP Plus型高效液相色谱仪,日本岛津公司;UV-1800型紫外可见分光光度计,上海美谱达有限公司;QUINTIX35-1CN PC型电子天平,德国赛多利斯公司;LXJ-IIB型低速离心机,海安亭科学仪器厂;RE-5LC型旋转蒸发仪、DF-101S型恒温加热磁力搅拌器,河南省予华仪器有限公司;KH5200E型超声波清洗器,昆山禾创超声仪器有限公司。

1.2 靛蓝提取物的制备

1.2.1靛蓝酸化物的制备 参考文献[9]制备靛蓝酸化物:取30 g靛蓝粗提物于250 mL锥形瓶内,加入150 mL水,置于80 ℃的恒温水浴锅中搅拌均质10 min。然后缓慢分批滴加20%(质量分数,下同)盐酸水溶液直到反应液pH值为2～3,搅拌反应40 min。离心得下层固体用100 ℃水洗涤至中性并于80 ℃下烘干,即得靛蓝酸化物(产率92.31%,含靛蓝20.13%,靛玉红0.26%)。

1.2.2靛蓝还原物的制备 参考文献[11]制备靛蓝还原物:取2 g靛蓝酸化物置于250 mL锥形瓶,加入100 mL水和3 g氢氧化钠,置于80 ℃恒温水浴锅中搅拌30 min。离心后将下层滤渣转入锥形瓶中,再加入100 mL水、 3 g氢氧化钠和2.5 g葡萄糖,瓶口用封口膜密封后于60 ℃恒温水浴下搅拌反应50 min。反应后离心得上层液体,用气泵通入空气2 min,再滴加20%盐酸至pH值为3～4,再次离心分离,下层沉淀用超纯水洗涤至中性,沉淀于80 ℃下烘干,即得靛蓝还原物(产率76.88%,含靛蓝85%,靛玉红0.86%)。

1.2.3乙酸乙酯提取物的制备 参考文献[11]制备靛蓝还原物:取20 g靛蓝酸化物于500 mL烧杯中,加入200 mL乙酸乙酯超声波处理30 min。过滤,滤渣用乙酸乙酯重复萃取2次,合并滤液,蒸发乙酸乙酯溶剂后,80 ℃烘干即得乙酸乙酯提取物(产率66.45%,含靛蓝35%,靛玉红23.16%)。

1.3 靛蓝提取物成分及含量分析

1.3.1对照品溶液的制备 分别精确称取靛蓝标准品5 mg、靛玉红标准品3 mg,置于100 mL棕色容量瓶中,加DMF至刻度线下3～4 cm,超声波处理使其溶解后定容,作为标准品溶液。

1.3.2供试品溶液的制备 分别精确称取靛蓝酸化物15 mg、靛蓝还原物5 mg、乙酸乙酯提取物5 mg置于100 mL棕色容量瓶中,加DMF至刻度线下3～4 cm,超声波处理使其溶解后定容,作为供试品溶液。

1.3.3HPLC方法学考察 高效液相色谱条件:流动相为甲醇/水,体积比7∶3;色谱柱YMC-AC-ODSA(250 mm×4.6 mm,5 μm),5 000塔板数柱效;检测波长600 nm;流速1 mL/min。

线性关系考察:分别精确吸取1、 2、 4、 6、 8 mL靛蓝、靛玉红标准品溶液至10 mL棕色容量瓶中,加DMF稀释至刻度摇匀。按色谱条件分别进样,记录 HPLC 色谱图。

稳定性试验:分别取靛蓝酸化物、靛蓝还原物、乙酸乙酯提取物样品溶液,避光放置。在0、 2、 4、 8、 12、 24 h按色谱条件,分别测试其靛蓝、靛玉红含量。精密度试验:取20 mg/L靛蓝和18 mg/L靛玉红标准品溶液,分别测定标准品溶液中靛蓝、靛玉红浓度,连续进样6次。重复性试验:取同一种供试品粉末精确称量,共6份,制备供试品溶液,分别测试其靛蓝、靛玉红含量。加样回收率试验:取已知含量靛蓝酸化物、靛蓝还原物、乙酸乙酯提取物样品各6份,精确称取,置于100 mL棕色容量瓶中,分别精确加入0.05 g/L靛蓝标准品溶液5 mL,乙酸乙酯提取物样品再加入0.05 g/L靛玉红标准品溶液5 mL,加DMF至刻度线下3～4 cm,超声波处理使其溶解,并用DMF定容。计算靛蓝、靛玉红加样回收率。

1.3.4紫外可见分光光度法方法学考察 紫外可见分光光度法条件:DMF为空白,在200～800 nm的波段扫描。

线性关系考察:以DMF为空白, 将不同浓度靛蓝、靛玉红标准溶液用分光光度计在200～800 nm的波段进行扫描,由图谱确定靛蓝、靛玉红最大吸收波长(610 nm和545 nm)。以靛蓝、靛玉红溶液的浓度为横坐标,靛蓝、靛玉红在其最大吸收波长处吸光度为纵坐标拟合出回归方程。以DMF为空白,在200～800 nm的波段测定待测样品溶液的吸收光谱,将两个最大吸收波长处吸光度值代入回归方程,分别计算出待测样溶液中靛蓝、靛玉红的含量。

稳定性试验:以DMF为空白对照,在0、 2、 4、 8、 12、 24 h用紫外分光光度计分别于靛蓝、靛玉红最大吸收波长处测定靛蓝酸化物、靛蓝还原物、乙酸乙酯提取物样品溶液,计算得其靛蓝、靛玉红含量。精密度试验:以DMF为空白,对20 mg/L靛蓝和18 mg/L靛玉红标准品溶液用紫外分光光度计扫描图谱,重复6次。重复性试验:取同一种供试品粉末精确称量,共6份,制备供试品溶液,分别测试其靛蓝、靛玉红含量。加样回收率试验:按1.3.3节中描述的方法进行加样,用分光光度法测定紫外图谱,计算回收率。

1.3.5双波长紫外分光光度法方法学考察 双波长紫外分光光度法条件与紫外可见分光光度法相同。

线性关系考察:以DMF为空白, 将不同浓度靛蓝、靛玉红标准溶液用分光光度计在200～800 nm的波段进行扫描,由图谱确定靛蓝、靛玉红最大吸收波长(610 nm和545 nm)。以靛蓝、靛玉红溶液的浓度(c)为横坐标,靛蓝、靛玉红在波长610 nm或545 nm处吸光度(A)为纵坐标绘制4个标准曲线。根据Lambert-beer定律:A=Ec[13],由标准曲线得到4个吸光系数(E)。由于靛蓝、靛玉红的光谱相互重叠,根据吸光度加和性原理[17]联立方程(见式(1)和式(2)),拟合出二元一次方程。

A1=E1c1+E3c2

(1)

A2=E2c1+E4c2

(2)

式中:A1—溶液在靛蓝最大吸收波长(610 nm)处的吸光度;c1—靛蓝在待测溶液中的质量浓度,mg/L;c2—靛玉红在待测溶液中的质量浓度,mg/L;A2—溶液在靛玉红最大吸收波长(545 nm)处的吸光度;E1、E3—靛蓝、靛玉红溶液分别在靛蓝最大吸收波长处的吸光系数;E2、E4—靛蓝、靛玉红溶液分别在靛玉红最大吸收波长处的吸光系数。

以DMF为空白,在200～800 nm的波段测定待测样品溶液的吸收光谱,将2个最大吸收波长处吸光度值代入上述二元一次方程,计算出待测样溶液中靛蓝、靛玉红的含量。

稳定性试验、精密度试验、重复性试验和加样回收率试验操作均同1.3.4节。

1.4 分析方法

1.4.1灰分分析 参照2020年版《中华人民共和国药典》[8]中灰分测定的方法测定靛蓝提取物。

1.4.2统计学分析 利用Kolmogorov-Smirnov法[18]检验样品的正态分布,如果符合正态分布,测定误差属于随机误差,用t检验[19]考察3种分析方法中两两检测值的差异是否显著,并利用Bland-Altman偏差图[20]比较测定结果值的高低,以及通过Spearman法[21]检验3种分析方法两两测定结果的相关性。

2 结果与讨论

2.1 灰分分析

各样品含灰分及酸不溶灰分如表1所示。由表1可知,靛蓝粗提物含灰分49.53%,酸不溶灰分10.58%,两种灰分差值较大,说明靛蓝粗提物中存在大量的CaCO3、Ca(OH)2、石灰等,酸不溶灰分是非石灰类杂质,如SiO2;靛蓝酸化物含灰分13.35%,酸不溶灰分5.84%,说明靛蓝粗提物经酸化处理后仍有较多无机物杂质;乙酸乙酯提取物含灰分3.93%,酸不溶灰分2.73%,说明乙酸乙酯提取物中无机物含量较少,有机物含量较高。靛蓝还原物含灰分仅为1.7%,且酸不溶灰分为1.59%,说明靛蓝还原物的主要成分为有机成分,且石灰类杂质已基本除尽。以上数据说明靛蓝粗提物中大部分成分是灰分,还原法和乙酸乙酯提取法能去除靛蓝提取物中绝大部分灰分,且效果较好。

表1 各样品灰分及酸不溶灰分测定结果

2.2 方法学考察结果分析

2.2.1线性关系 在HPLC法、紫外可见分光光度法、双波长紫外分光光度法下靛蓝和靛玉红标准品的回归方程、相关系数和线性范围见表2。表2结果显示,所有回归方程的相关系数都不小于0.992,表明这3种方法中靛蓝和靛玉红在所测浓度范围内进样浓度(X)与峰面积(Y)呈良好的线性关系。

表2 各成分的线性关系

由表2可知,靛蓝在610 nm和545 nm处的吸光系数分别为68.31和24.50,靛玉红的则为5.90和38.21,依据式(1)和式(2)得到双波长紫外分光光度法测定溶液在610 nm处的吸光度的计算公式:A610=68.31c1+5.90c2,溶液在545 nm处的吸光度的计算公式:A545=24.50c1+38.21c2。

2.2.2精密度 HPLC法测靛蓝含量相对标准偏差(RSD)平均值为0.49%,靛玉红含量RSD平均值为0.44%,表明HPLC法仪器精密度良好;紫外分光光度法测靛蓝含量RSD平均值为0.30%,靛玉红含量RSD平均值为0.37%,表明紫外可见分光光度法仪器精密度良好;双波长紫外分光光度法测靛蓝含量RSD平均值为0.38%,靛玉红含量RSD平均值为0.32%,表明双波长紫外分光光度法仪器精密度良好。

2.2.3稳定性 用高效液相色谱法测定靛蓝、靛玉红含量时,发现12 h内靛蓝酸化物、靛蓝还原物、乙酸乙酯提取物中靛蓝质量分数的RSD分别为1.96%、 0.56%和1.15%,乙酸乙酯提取物中靛玉红质量分数的RSD为2.92%。

用紫外可见分光光度法测定靛蓝、靛玉红含量时,发现12 h内靛蓝酸化物、靛蓝还原物、乙酸乙酯提取物中靛蓝质量分数的RSD分别为2.05%、 0.73%和0.17%,乙酸乙酯提取物中靛玉红质量分数的RSD为0.09%。

用双波长紫外分光光度法测定靛蓝、靛玉红含量时,发现12 h内靛蓝酸化物、靛蓝还原物、乙酸乙酯提取物中靛蓝质量分数的RSD分别为1.95%、 0.54%和0.17%,乙酸乙酯提取物中靛玉红质量分数的RSD为0.09%。

以上数据表明:样品溶液在3种分析方法下12 h内稳定性良好。

2.2.4重复性 用高效液相色谱法测定靛蓝、靛玉红含量时,靛蓝酸化物、靛蓝还原物、乙酸乙酯提取物中靛蓝质量分数的RSD分别为2.37%、 0.90%和0.53%,乙酸乙酯提取物中靛玉红质量分数的RSD为1.88%。

用紫外可见分光光度法测定靛蓝、靛玉红含量时,靛蓝酸化物、靛蓝还原物、乙酸乙酯提取物中靛蓝质量分数的RSD分别为1.36%、 1.05%和5.45%,乙酸乙酯提取物中靛玉红质量分数的RSD为1.58%。

用双波长紫外分光光度法测定靛蓝、靛玉红含量时,靛蓝酸化物、靛蓝还原物、乙酸乙酯提取物中靛蓝质量分数的RSD分别为1.15%、 1.16%和5.21%,乙酸乙酯提取物中靛玉红质量分数的RSD为4.29%。

以上分析表明:靛蓝酸化物、靛蓝还原物中靛蓝和乙酸乙酯提取物中靛玉红在3种分析方法下重复性较好(RSD≤2%),乙酸乙酯提取物中靛蓝在3种分析方法下重复性较差(RSD>5%)。

2.2.5加样回收率 用高效液相色谱法测定靛蓝、靛玉红含量的加样回收率,靛蓝酸化物、靛蓝还原物、乙酸乙酯提取物中靛蓝平均加样回收率及其RSD分别为98.45%、 98.45%、 106.14%和4.64%、 1.04%、 2.73%,乙酸乙酯提取物中靛玉红平均加样回收率及其RSD分别为95.7%和1.08%。 数据表明:靛蓝酸化物中靛蓝平均加样回收率一般,靛蓝还原物、乙酸乙酯提取物中靛蓝平均加样回收率和乙酸乙酯提取物中靛玉红平均加样回收率较好。

用紫外可见分光光度法测定靛蓝、靛玉红含量的加样回收率,靛蓝酸化物、靛蓝还原物、乙酸乙酯提取物中靛蓝平均加样回收率及其RSD分别为99.03%、 95.44%、 96.93%和2.90%、 2.51%、 2.27%,乙酸乙酯提取物中靛玉红平均加样回收率及其RSD分别为95.43%和2.51%。数据表明: 3种样品溶液中靛蓝和乙酸乙酯提取物中靛玉红平均加样回收率均较好。

用双波长紫外分光光度法测定靛蓝、靛玉红含量的加样回收率,靛蓝酸化物、靛蓝还原物、乙酸乙酯提取物中靛蓝平均加样回收率及其RSD分别为102.93%、 96.14%、 94.19%和4.09%、 2.12%、 1.71%,乙酸乙酯提取物中靛玉红平均加样回收率及其RSD分别为98.18%和3.45%。数据表明:靛蓝酸化物中靛蓝平均加样回收率和乙酸乙酯提取物中靛玉红平均加样回收率一般,靛蓝还原物和乙酸乙酯提取物中靛蓝平均加样回收率较好。

2.3 统计学试验结果分析

2.3.1靛蓝酸化物数据分析 通过3种分析方法分析不同靛蓝酸化物中靛蓝含量,经Kolmogorov-Smirnov检验,HPLC法、紫外可见分光光度(UV)法和双波长紫外分光光度(dW-UV)法的置信概率(P)分别为0.31、 0.37、 0.11,这3组数据均符合正态分布。两两比较的差值配对t检验结果为PHPLC vs UV<0.01,PHPLC vs dW-UV<0.01,PUV vs dW-UV<0.01,数据表明这3种分析方法两两之间存在显著差别。通过Bland-Altman偏差图比较两种分析方法测定结果的均值(图1),结果显示:UV法较HPLC法高1.44%(差值的平均值与差值的95%置信区间(95%CI):-2.83%～-0.045%);dW-UV法较HPLC法高5.73%(95%CI:-13.64%～2.19%);UV法较dW-UV法低4.29%(95%CI:-11.54%～2.96%)。

a.HPLC vs UV; b.HPLC vs dW-UV; c. UV vs dW-UV

Spearman检验考察两两不同方法测定结果的相关性:YUV=1.043XHPLC+0.413(R=0.989,P<0.001);YdW-UV=1.26XHPLC-0.519(R=0.899,P<0.001);YdW-UV=1.21XUV-1.509(R=0.890,P<0.001)。

Bland-Altman和Spearman检验结果说明:靛蓝酸化物的HPLC法和UV法测量数据两两之间存在不一致性(不是所有测量数据均介于95%置信区间范围内),HPLC法和dW-UV法测量数据两两之间具有一致性,UV法和dW-UV法测量数据两两之间具有一致性。

2.3.2靛蓝还原物数据分析 通过3种分析方法分析不同靛蓝还原物中靛蓝含量,经Kolmogorov- Smirnov检验,HPLC法、UV法和dW-UV法的P分别为0.16、 0.20和0.10, 3组数据均符合正态分布。两两比较的差值配对t检验结果(PHPLC vs UV<0.01,PHPLC vs UV<0.01,PUV vs dW-UV<0.01)表明3种分析方法两两之间存在显著差别。利用Bland-Altman偏差图比较两种方法测定结果均值的高低(图2),结果显示:UV法较HPLC法低1.17%(95%CI:-3.20%～5.54%);dW-UV法较HPLC法高2.46%(95%CI:-6.74%～2.18%);UV法较dW-UV法低3.63%(95%CI:-6.16%～-1.11%)。

a.HPLC vs UV; b.HPLC vs dW-UV; c.UV vs dW-UV

Spearman检验考察两两不同方法测定结果的相关性:YUV=1.053XHPLC-4.919(R=0.907,P<0.001);YdW-UV=1.065XHPLC-2.089(R=0.941,P<0.001);YdW-UV=1.007XUV+3.157(R=0.971,P<0.001)。

Bland-Altman和Spearman检验结果说明:靛蓝还原物的HPLC法和UV法测量数据两两之间存在不一致性,HPLC法和dW-UV法测量数据两两之间具有良好的一致性,UV法和dW-UV法测量数据两两之间具有不一致性。

2.3.3乙酸乙酯提取物数据分析

2.3.3.1靛蓝 通过3种分析方法分析不同乙酸乙酯提取物中靛蓝含量,经Kolmogorov-Smirnov检验,HPLC法、UV法和dW-UV法的P分别为0.20、 0.20和0.20,3组数据均符合正态分布。两两比较的差值配对t检验结果(PHPLC vs UV=0.476,PHPLC vs dW-UV=0.215,PUV vs dW-UV=0.699)表明3种分析方法两两之间无显著差别。利用Bland-Altman偏差图比较两种方法测定结果均值的高低(图3),结果显示:UV法较HPLC法高0.23%(95%CI:-2.94%～2.49%);dW-UV法较HPLC法高0.30%(95%CI:-2.32%～1.73%);UV法较dW-UV法低0.07%(95%CI:-1.65%～1.51%)。

a.HPLC vs UV; b.HPLC vs dW-UV; c.UV vs dW-UV

Spearman检验考察两两不同方法测定结果的相关性:YUV=0.973XHPLC+0.541(R=0.967,P<0.001);YdW-UV=1.028XHPLC-0.031(R=0.983,P<0.001);YdW-UV=1.032XUV-0.307(R=0.975,P<0.001)。

Bland-Altman和Spearman检验结果说明:乙酸乙酯提取物的HPLC法和UV法测量数据两两之间、HPLC法和dW-UV法测量数据两两之间均具有不一致性,UV法和dW-UV法测量数据两两之间具有良好的一致性。

2.3.3.2靛玉红 通过3种分析方法分析不同乙酸乙酯提取物中靛玉红含量,经Kolmogorov-Smirnov检验HPLC法、UV法和dW-UV法的P分别为0.20、 0.20和0.20, 3组数据均符合正态分布。两两比较的差值配对t检验结果(PHPLC vs UV<0.01,PHPLC vs dW-UV<0.01,PUV vs dW-UV<0.01)表明3种分析方法两两之间存在显著差别。利用Bland-Altman偏差图比较两种方法测定结果均值的高低(图4),结果显示:UV法较HPLC法高7.16%(95%CI:-15.61%～1.28%);dW-UV法较HPLC法高1.98%(95%CI:-4.25%～0.29%);UV法较dW-UV法高5.18%(95%CI:-1.37%～11.73%)。

a.HPLC vs UV; b.HPLC vs dW-UV; c.UV vs dW-UV

Spearman检验考察两两不同方法测定结果的相关性:YUV=1.297XHPLC-1.493(R=0.907,P<0.001);YdW-UV=1.078XHPLC-0.281(R=0.941,P<0.001);YdW-UV=0.824XUV+1.195(R=0.971,P<0.001)。

Bland-Altman和Spearman检验结果说明:乙酸乙酯提取物的HPLC法和UV法测量数据两两之间、HPLC法和dW-UV法测量数据两两之间、UV法和dW-UV法测量数据两两之间均具有不一致性。

2.4 分析方法的准确性与实用性评价

2.4.1靛蓝酸化物分析方法评价 通过方法学考察与t检验结果可知,用于分析靛蓝酸化物的3种方法两两之间存在显著差别,HPLC法测量靛蓝酸化物重复性一般,RSD为2.37%,加样回收率一般,加样回收率范围在95.04%～110.14%,RSD为4.64%;dW-UV法测量靛蓝酸化物,回收率在96.36%～106.08%之间,RSD为4.09%,回收率一般,而UV法测量靛蓝酸化物样品,虽然加样回收率一般,加样回收率范围为95.71%～107.64%,RSD为2.90%,但其精密度、重复性、稳定性均良好。因此,针对靛蓝酸化物,由于样品中含有未中和的碳酸钙等无机杂质,靛蓝含量低,采用UV法比dW-UV法和HPLC法更快捷和稳定。

2.4.2靛蓝还原物分析方法评价 通过方法学考察与t检验结果可知,3种方法测量靛蓝还原物,精密度、重复性、稳定性均良好。HPLC法加样回收率良好,靛蓝加样回收率在96.88%～99.76%,RSD为1.04%;UV法加样回收率一般,加样回收率范围为:95.71%～107.64%,RSD为2.51%;dW-UV法加样回收率一般,加样回收率范围为:93.51%～99.78%,RSD为2.12%;靛蓝还原物中靛蓝含量明显高于靛蓝酸化物,碳酸钙等无机杂质减少,因此,采用HPLC法分析最精准;采用UV法、dW-UV法较为准确,3种方法均可用于分析靛蓝还原物中靛蓝含量。由于UV法更加便捷快速,所以分析靛蓝还原物中靛蓝最佳方法为UV法。

2.4.3乙酸乙酯提取物分析方法评价 通过方法学考察与t检验结果可知,用于分析乙酸乙酯提取物的3种方法两两之间存在显著差别,HPLC法测量乙酸乙酯提取物中靛蓝含量,其精密度、重复性、稳定性均良好,加样回收率一般,加样回收率范围为101.20%～109.74%,RSD为2.73%;UV法、dW-UV法精密度、稳定性良好,但重复性较差,其RSD分别为5.45%、 5.21%。很明显,乙酸乙酯提取物中碳酸钙等无机杂质更少,有机物增多,靛蓝含量高。因此,采用HPLC法较好,而UV法、dW-UV法重复性差、不适用。

HPLC法测量乙酸乙酯提取物中靛玉红含量,其精密度、重复性、加样回收率均良好。稳定性一般,RSD为2.92%;UV法、dW-UV法精密度、稳定性均良好,但dW-UV法的重复性较差,其RSD为4.29%,UV法的加样回收率一般,加样回收率范围为90.78%～99.15%,RSD为2.51%。

乙酸乙酯提取物中靛玉红含量分析适合用HPLC法和UV法。综合结果可知,分析乙酸乙酯提取物中靛蓝、靛玉红含量的最佳方法为HPLC法。

3 结 论

3.1建立了靛蓝酸化物、靛蓝还原物以及乙酸乙酯提取物中成分含量的HPLC法、紫外可见分光光度法、双波长紫外分光光度法3种分析方法,方法学考察结果表明:所建立的3种分析方法的线性关系良好、灵敏度高、稳定性好、重复性好、准确度好,是3种可靠的靛蓝提取物成分含量分析方法。

3.2通过经Kolmogorov-Smirnov法、t检验、Bland-Altman偏差图和Spearman法等统计学方法对3种靛蓝提取物分析方法进行分析,结果表明:HPLC法准确性更高,但是相较于紫外可见分光光度法与双波长紫外分光光度法耗时更长,更繁琐;靛蓝酸化物中靛蓝含量不高,含有较多的碳酸钙等无机杂质,采用紫外可见分光光度法比双波长紫外分光光度法和HPLC法更加快捷和稳定;3种分析方法均可用于靛蓝还原物中靛蓝含量的分析,由于靛蓝还原物中靛蓝含量较高,杂质对靛蓝含量分析影响较小,故紫外可见分光光度法更便捷快速;乙酸乙酯提取物中碳酸钙等无机杂质少,有机物增多,靛玉红含量高,采用HPLC法较好。