博落回提取物对脂多糖刺激的肉仔鸡抗氧化功能、免疫功能及肠道紧密连接蛋白表达的影响

■ 刘同岳 安文东 张文龙 马登军 张 童 李文立 张贝贝

（青岛农业大学动物科技学院，山东青岛 266000）

近年，随着肉鸡集约化养殖规模不断扩大，肉鸡免疫应激和肠道健康问题日益突出。肉鸡发病率高带来的饲料浪费和环境污染等问题，成为制约我国肉鸡产业优质高效发展的重要因素，阻碍了畜牧业的可持续发展[1]。肉鸡在生产过程中不可避免地会遭受到一些革兰氏阴性菌如大肠杆菌、沙门氏菌的侵袭，脂多糖（LPS）是革兰氏阴性菌细胞壁的主要成分，可引起肉鸡免疫应激反应[2]。随着近些年饲料禁抗政策在畜禽养殖业中不断完善和实施，寻找绿色安全的新型添加剂，通过营养调控措施来维持肉鸡产业的健康高效发展成为需要迫切解决的问题。

博落回（Macleaya cordata）又名“号筒杆”，为罂粟科博落回属的多年生草本植物，是我国传统的中药材。博落回在我国分布广泛，资源丰富，主要分布在贵州、湖南、四川、安徽等地[3]，其提取物的主要有效成分为异喹啉类生物碱，包括血根碱、白屈菜红碱、别隐品碱等[4]。2004年，以血根碱和白屈菜红碱为主要成分的博落回提取物产品在欧盟注册为饲料添加剂。2012年，农业农村部将博落回散批准为第一个中兽药类药物饲料添加剂（批准文号：兽药添字180415250，兽药添字180415329）。众多研究表明，博落回提取物具有良好的消炎杀菌、抗病毒、抗氧化等生物学活性和增强机体免疫、提高生产性能等生物学功能[5-7]。博落回提取物可缓解由环磷酰胺引起的免疫抑制蛋鸡的生长性能、免疫功能和抗氧化功能的下降，提高饲料转化率[8]。王曼等[9]试验研究表明，博落回提取物在替代抗生素，提高白羽肉鸡生长性能、抗氧化能力、降低炎症反应、改善机体健康等方面具有明显效果。然而，目前关于博落回提取物对LPS 引起的免疫应激肉鸡的抗氧化功能、免疫功能和肠道屏障功能的影响未见报道。本试验旨在研究在LPS 的刺激下，博落回提取物对肉鸡抗氧化功能、免疫功能及肠道紧密连接蛋白表达的影响。

1 材料与方法

1.1 试验材料

博落回提取物由湖南美可达生物资源股份有限公司提供，其中血根碱、白屈菜红碱有效含量分别为0.15%和0.075%。LPS 购自Sigma 公司（L-2880），来源于血清型为O55∶B5的大肠杆菌。雄性AA 肉仔鸡购自烟台大地牧业股份有限公司。

1.2 试验设计

试验采用2×2 因子随机区组设计，主因子分别为博落回添加水平（0、400 mg/kg）和免疫处理（注射生理盐水或LPS）。选取健康、体重相近的1 日龄AA 雄性肉仔鸡256 只，随机分为4 组，每组8 个重复，每个重复8 只鸡。4 组分别为对照组（CON）、博落回组（MCE）、脂多糖组（LPS）和MCE+LPS 组，其中CON 组和LPS 组饲喂基础饲粮，MCE 组和MCE+LPS 组在基础饲粮中添加400 mg/kg MCE。LPS 组和MCE+LPS组肉鸡分别在第15、17、19 和21 日龄腹腔皮下注射1 mg/kg 体重的LPS，CON 和MCE 组注射等量的生理盐水。基础饲粮配制参考《鸡饲养标准》（NY/T 33—2004），其组成及营养水平见表1。

表1 基础饲粮组成及营养水平（风干基础）

1.3 饲养管理

饲养试验于青岛市莱西市一科研试验基地进行，饲养方式为层叠式笼养，试验期为21 d。试验鸡饲喂粉料，自由采食和饮水。饲养管理程序严格按照肉鸡常规饲养方法进行。

1.4 样品采集

21日龄，肉鸡最后一次注射LPS或生理盐水后3 h，分别从每个重复（笼）中随机挑选1 只中等大小的鸡，翅静脉采集肝素钠抗凝血，用于检测血浆抗氧化指标、免疫球蛋白水平和iNOS活性。颈静脉放血屠宰，剖开腹腔分离各部位肠道。采集空肠一小段（约1 cm）装入2 mL 无RNA 酶离心管中，液氮速冻后保存于-80 ℃，用于检测肠道屏障相关基因表达情况。

1.5 血浆抗氧化指标测定

将采集的血液样本在4 ℃下以3 000 r/min 离心10 min，取上清制备血浆，分装后-20 ℃保存。使用南京建成生物工程研究所有限公司试剂盒检测血浆中总抗氧化能力（T-AOC）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSHPx）、过氧化氢酶（CAT）以及超氧化物歧化酶（TSOD）的酶活。

1.6 血浆免疫球蛋白水平测定

按照试剂盒说明书采用酶联免疫法（ELISA）检测血浆中免疫球蛋白IgA、IgG 和IgM 水平，检测试剂盒购自上海酶联生物科技有限公司。

1.7 血浆一氧化氮合酶酶活测定

血浆iNOS 含量采用ELISA 检测，试剂盒购自上海酶联生物科技有限公司。

1.8 空肠紧密连接蛋白mRNA表达量测定

用Trizol 法提取空肠组织中总RNA。用核酸蛋白测定仪测定总RNA 浓度，确保OD260/OD280值在1.8～2.0 范围内，并通过1.0%琼脂糖凝胶进行电泳，检测RNA 完整性。使用Prime Script RT 试剂盒进行反转录合成cDNA。使用TB Green Premix Ex Taq 试剂盒进行荧光定量，采用25 μL 体系，以GAPDH 为内参基因，采用Bio-Rad CFX96 荧光定量PCR 仪进行测定。根据2-ΔΔCt方法计算各处理空肠中目的基因的mRNA相对表达量。引物序列见表2。

表2 引物序列及参数

1.9 数据统计与分析

试验数据使用SPSS 25.0 软件进行双因素分析，统计博落回提取物水平、LPS 刺激的主效应及二者互作效应。互作效应显著时，进行单因素方差分析，用Duncan’s 法进行多重比较，结果用“平均值”和“合并标准误（SEM）”表示，P<0.05为差异显著。

2 结果与分析

2.1 博落回提取物对肉鸡血浆抗氧化指标的影响

由表3 可知，LPS 注射显著降低了肉鸡血浆TAOC、CAT、GSH-Px、T-SOD 的活性（P<0.05），添加博落回提取物显著升高了肉鸡血浆GSH-Px 和T-SOD活性（P<0.05），博落回提取物添加和LPS 注射对肉鸡血浆T-AOC、CAT、GSH-Px、T-SOD 的活性无显著交互作用（P>0.05）。

表3 博落回提取物对肉鸡血浆抗氧化指标的影响(U/mL)

2.2 博落回提取物对肉鸡血浆免疫球蛋白水平的影响

由表4 可知，与饲喂基础日粮相比，日粮添加博落回提取物可显著提高肉鸡血浆中IgG 的含量（P<0.05），对血浆IgA与IgM的含量无显著影响（P>0.05）。LPS 注 射 对IgG、IgA、IgM 水 平 均 无 显 著 影 响（P>0.05）。

表4 博落回提取物对肉鸡血浆免疫球蛋白水平影响

2.3 博落回提取物对肉鸡血浆iNOS活性的影响

由图1 可知，与饲喂基础日粮相比，日粮中添加博落回提取物可显著降低肉鸡血浆中iNOS 的活性（P<0.05）。LPS 主效应及LPS+博落回提取物添加二者互作对肉鸡血浆iNOS活性无显著影响（P>0.05）。

图1 博落回提取物对肉鸡血浆iNOS活性的影响

2.4 博落回提取物对肉鸡空肠紧密连接蛋白mRNA表达量的影响

由表5 可知，LPS 处理显著提高了肉鸡空肠Claudin-2 mRNA 表达量（P<0.05），显著降低了空肠Occludin、ZO-1 和ZO-2 的mRNA 表达量（P<0.05），与饲喂基础日粮相比，日粮添加博落回提取物可显著提高空肠 紧 密 连 接 蛋 白Claudin-3、Occludin和ZO-2 的mRNA 表达量（P<0.05）。博落回提取物添加、LPS 注射及二者互作对空肠Claudin-1 的mRNA 表达量均无显著影响（P>0.05）。

表5 博落回提取物对肉鸡空肠紧密连接蛋白mRNA表达量的影响

3 讨论

3.1 博落回提取物对肉鸡血浆抗氧化功能的影响

在现代化、集约化、规模化养殖管理过程中，肉鸡极易受外界刺激而产生应激行为，导致疾病和经济损失。然而，肉鸡的抗氧化能力是其抗应激能力和生产性能发挥的关键。抗氧化酶活性下降和自由基增加会导致禽类产生机能障碍，使机体诱发炎症。王云等[10]的体外抗氧化试验结果显示，博落回提取物白屈菜红碱具有良好的清除自由基的能力。另有研究表明，博落回中的有效成分血根碱对还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADPH）的活性具有破坏作用，主要利用抗氧化物酶CAT、SOD、GSH-Px 等来发挥清除多余自由基、防止细胞氧化损伤的作用[11]。王曼等[9]研究表明，博落回提取物能够有效改善白羽肉鸡的抗氧化能力，降低MDA 含量，提高T-AOC 的活性，同时也证实了博落回提取物中的血根碱不是直接作用于活性氧，而是通过促进酶的活性和抑制活性氧的通路来提高动物抗氧化能力。夏超笃等[12]试验结果显示，添加博落回提取物可显著降低断奶仔猪MDA 含量，提高T-SOD 活性和GSH-Px 含量,提高机体抗氧化功能。本试验结果显示，LPS 的刺激降低了肉鸡血浆TAOC、CAT、GSH-Px、T-SOD 的活性，博落回提取物通过提高肉鸡血浆抗氧化酶GSH-Px 和T-SOD 活性，达到了提高肉鸡抗氧化的功能。由此，日粮中添加博落回提取物可提高LPS 刺激的肉鸡的抗氧化能力，增强抗应激能力。

3.2 博落回提取物对肉鸡血浆免疫功能和iNOS活性的影响

在动物机体内，免疫球蛋白IgG、IgA、IgM 介导以抗感染为主的体液免疫。由动物机体B 淋巴细胞分泌产生的血浆抗体活性物质IgA、IgG、IgM，能够反映动物的免疫能力[13]。有研究发现，博落回提取物能够促进肉鸡免疫器官法氏囊的发育，通过增加IgA、IgG、IgM 等抗体活性物质，能够增加IgA、IgG、IgM 的抗体水平，减少NO 的产生，抑制炎症，增强机体免疫力[14]。黄海[15]研究发现，血根碱和白屈菜红碱可使麻花肉鸡血清中IgA、IgG 含量明显增加。本试验结果显示，LPS 注射对抗体水平IgA、IgG、IgM 无显著影响，但添加博落回提取物显著提高了肉鸡血浆中IgG 抗体水平，证实博落回提取物能够改善肉鸡免疫功能，提高肉鸡抗感染的能力。

NO 是介导炎症反应的关键因子，由iNOS催化L-精氨酸产生。应激和炎症时iNOS 的表达会增加，可以诱导巨噬细胞等表达iNOS mRNA，并再翻译成iNOS，促进NO的分泌[16]。本试验结果显示，添加博落回提取物降低了肉鸡血浆中iNOS 的表达量。由此可知，博落回提取物可能通过抑制iNOS mRNA 的表达量，下调iNOS 蛋白的表达，进而抑制NO 的合成，从而发挥抗炎的功能。

3.3 博落回提取物对肉鸡空肠紧密连接蛋白基因表达的影响

肠上皮细胞是抵御外界环境刺激的重要物理屏障，而紧密连接蛋白是构成肠道上皮屏障功能的主要结构蛋白，其主要由3 种类型的跨膜蛋白组成，其中Zonulin 是一组支架蛋白，紧密连接胞质斑块的一部分；Claudin和Occludin是调节肠上皮屏障功能最重要组成部分，可以封闭细胞间间隙，决定肠道上皮细胞的选择通透性，起到调节肠道屏障功能、改善肠道健康的作用[17]。肠道紧密连接的破坏，将导致肠道屏障结构受损和肠道通透性增加。本试验结果显示，LPS注 射 显 著 降 低 肉 鸡 空 肠Occludin、ZO-1、ZO-2 的mRNA 相对表达量，而博落回提取物显著提高了肉鸡空肠Occludin、Claudin-3、ZO-2 与紧密连接蛋白相关基因的表达活性，表明博落回提取物添加可缓解LPS刺激引起的肉鸡肠道紧密连接蛋白表达量下降，改善肠道物理屏障功能。与本研究结果相似的是，柴毛毛等[18]研究表明，博落回提取物可显著提高黄羽肉鸡盲肠中Claudin-1和ZO-1的基因表达量，促进紧密连接蛋白的表达。邹朋[19]研究表明，蛋鸡饲粮中添加博落回提取物提高了空肠微绒毛高度，显著提高蛋鸡养分利用率，降低料蛋比，且提高了蛋鸡空肠中Claudin-1、Occludin、ZO-1 的基因表达水平，改善了蛋鸡的肠道屏障功能。

4 结论

日粮中添加400 mg/kg 博落回提取物能提高LPS刺激的肉仔鸡的抗氧化能力，增强机体免疫功能，维护肠道屏障功能。