显微CT技术测量不规则多孔悬浮载体比表面积初探

杨吉平 郭黎明 王志 王朋

(上海耕海渔业有限公司,上海 200126)

循环水产养殖系统(recirculating aquaculture system,RAS)被视为是未来水产养殖的重要模式,是能满足不断增长的全球海产品需求的可持续解决方案。与网箱等传统养殖方式相比,RAS系统使用更少的水,并可避免将营养和有害废物直接排放到海洋中[1]。通过对海水养殖过程中碳、氮和磷排放的研究也表明,RAS系统对生态的影响也低于传统海洋渔业[2]。RAS系统需要良好的水质控制和废水管理才能确保获得足够的养殖产量和效益[3]。RAS中最关键的水处理过程是氧化有害的含氮化合物[4],这些含氮化合物包括氨、亚硝酸盐和某些情况下的硝酸盐。移动床生物膜反应器(MBBR)由于其简单性和低能耗而成为RAS系统中去除有害含氮化合物的默认设计选择[5]。

MBBR使用特殊设计的填料作为生物膜载体,通过曝气扰动、液体回流或机械推流混合可使载体在反应器中悬浮、翻滚运动[6]。这种特殊设计的填料被称为悬浮载体。悬浮载体是MBBR系统的核心部件,其主要功能是为微生物提供附着的场所。MBBR系统中首先使用的悬浮载体是AnoxKaldnesTM的K系列产品,K系列悬浮载体在直径、高度、生物膜发育的可用表面积、开孔位置方面有所不同[6]。至今为止,已有不同形状、不同材质、不同制造工艺生产的近50种悬浮载体用于MBBR中[6-7]。区分悬浮载体性能的重要指标是有效比表面积,有效比表面积是指单位体积悬浮载体填料能实现良好传质传氧,且能生长有效微生物的受保护的表面积[8]。比表面积与有效比表面积的差别在于,有效比表面积考虑了微生物实际传质及富集状态,载体在反应器中运动,会相互摩擦撞击,在载体外缘,微生物难以挂膜,这部分不能作为有效比表面积[9]。要想精确地计算有效比表面积,首先需要知道其比表面积。悬浮载体的比表面积一般为表面积和体积之比,即单位体积的悬浮载体的总表面积,单位为m2/m3[5]。目前已报道的比表面积最高的悬浮载体为Mutag公司的BioChip[7]和国内某公司生产的高比表面积填料。这两款悬浮载体均采用化学发泡工艺制作,提供的测定报告(BET气体吸附法)显示,其比表面积高达5 500 m2/m3。

国内对悬浮填料比表面积的测量和计算标准仅见于行业标准《水处理用高密度聚乙烯悬浮载体填料》(CJ/T 461—2014)[8]。该标准中提供的计算方式是:使用测量的几何尺寸数据进行计算。但化学发泡工艺制作的悬浮载体的孔洞大小不一,且为不规则球形,再加上切割的位置不同,通过测量几何尺寸进行计算非常困难。上述提到的两家公司采用了气体吸附法测量比表面积,相关方法参见《用气体吸附法分析介孔和微孔》(ISO 15901-2)以及《煤质颗粒活性炭试验方法 孔容积和比表面积的测定》(GB/T 7702.20—2008)。这两种测量方法基于BET原理,对真空度、控制系统、温度传感器、称量精度等有很高的要求,测量时间也比较长,而且该方法的参数设计主要针对介孔材料(2～50 nm)[10]。

近年来,显微CT技术(Micro CT,微计算机断层扫描技术)在微观结构研究方面的应用越来越广泛[11-14]。CT技术是一种无损的成像技术,能够探测材料内部的几何形态,可在不破坏悬浮载体孔隙结构的情况下获取到其细微结构图像,进而通过三维重构技术实现对悬浮载体的比表面积测量。本研究将使用显微CT技术对不规则多孔悬浮载体进行扫描建模,以期获得比表面积参数,并讨论测量结果的有效性,最终建立一种简单快速有效的悬浮载体比表面积测量方法。

1 材料和方法

1.1 材料

被测试样品1由国内某厂家提供,载体直径30 mm,堆积密度DB1=150 kg/m3。被测试样品2为Mutag公司生产的BioChip30。载体直径30 mm,堆积密度为DB2=165 kg/m3。

显微CT设备为Bruker SKYSCAN 1272 CMOS,由中国科学院分子细胞科学卓越创新中心提供公共服务。测量质量用的精密天平为梅特勒托利多ME204,最小称量精度10 mg,检定分度值1 mg。

1.2 测试方法

选取合适的载物台,将样品固定在载物台上,避免扫描过程中晃动影响扫描结果,将载物台固定在Bruker SKYSCAN 1272设备的样品架上,关闭仓门。依据样品的密度及成像效果调试设置参数,最终测试的参数见表1。

表1 Bruker SKYSCAN 1272测试参数设置

由于要求的图像像素尺寸较小,导致样品扫描视野不足以完整扫描单片样品,因此由仪器设定每次扫描只扫描样品的1/4,CT扫描后,将原始数据重建拼合,导入仪器自带的分析软件CTAn中进行三维成像并求解表面积AS。三维图像导出为stl格式,并用MeshLab 2022.2版本打开后选择合适的角度截图。

1.3 比表面积计算

样品比表面积ASS(m2/m3)的计算公式为:

(1)

式(1)中,AS为求解获得的表面积,mm2;m为载体样品质量,g;DB为堆积密度,kg/m3。其中m由精密天平测得,DB由厂商提供。

2 结果

2.1 CT扫描图像生成的模型

CT扫描图像生成的模型见图1。

注:a、b、c分别为样品1的侧面、正面和背面;d、e、f分别为样品2的侧面、正面和背面。

2.2 比表面积计算结果

显微CT分析结果为:样品1的表面积AS1=4 252.419 mm2,样品2的表面积AS2=4 513.080 mm2。经精密天平测试,样品1的质量m1=0.382 5 g,样品2的质量m2=0.375 5 g。以上数据结合厂商提供的堆积密度(DB1、DB2)数据,代入公式1,计算得到样品1的比表面积为ASS1=1 667 m2/m3,样品2的比表面积为ASS2=1 983 m2/m3。

3 讨论

通过显微CT测量表面积并计算获得的比表面积数据与BET气体吸附法报告的数据有较大差异。查阅报告显示,计算比表面积所用的单片悬浮填料质量m和堆积体积DB数据相似,区别主要为单片悬浮填料的表面积AS的结果。可见测量方法是造成数据差异的主要原因。除使用前述两种方法外,也可通过数学模型进行估算。

3.1 BET气体吸附法

BET气体吸附法测定比表面积的原理为:使用相对压力在0.05～0.35范围内的吸附等温线数据,按照BET方程式(二常数公式)求出试样的单分子层吸附量,根据吸附质分子的截面积,可计算出试样的比表面积(m2/g)。本方法除与报告提供者标识的测量方法(见前言)一致外,还与国内和国际上通用的用气体吸附BET法测定固态物质比表面积的方法(国标GB/T 19587—2017/ISO9277:2010[15],后文简称“国标B”)基本一致。该方法认为,BET法的测试范围为Ⅱ型和Ⅳ型吸附等温线,如图2-a所示[15]。何云鹏等[16]认为,Ⅱ型等温线反映了非孔性或者大孔吸附剂上典型的物理吸附过程,等温线拐点通常出现在单层吸附线附近。查阅检测报告显示,检测过程中的吸附等温线为Ⅱ型等温线,且计算所得的单层吸附量所对应的点处于等温线拐点附近,说明测试类型符合“国标B”的要求(见图2-b)。另外,“国标B”中特意指出,C值大于200可能表明存在微孔(孔尺寸小于或约等于2 nm的孔)[15]。经查阅,检测报告中C值为271,这也提示,该类样品中可能存在微孔,且计入了表面积。已知该类型悬浮载体主要供给细菌栖息,细菌的大小约为0.5～5.0 μm,纳米(nm)级别的孔根本不适合细菌进入,因此,使用BET法测定不规则多孔悬浮载体的比表面积会将不适合细菌栖息的微孔表面积计入,使获得的比表面积比适合细菌栖息的比表面积大。

注:ne为比吸附量,P/P0为相对压力。(a)引自GB/T 19587—2017,典型的BET测试范围为Ⅱ型和Ⅳ型等温线图中的阴影区域。(b)引自样品2的比表面积检测报告(BET法)。

3.2 显微CT法

显微CT获得了悬浮载体的三维模型,通过软件直接统计了表面积,相比气体吸附法更加直接。通过对CT扫描图像的分析显示,不规则多孔悬浮填料的孔直径一般在97.5～1 200.0 μm。已有资料表明,不规则多孔悬浮载体的发泡剂为碳酸氢钠和柠檬酸。罗丹[17]的研究也证实,碳酸氢钠在聚烯烃中发泡的最小平均直径为108～163 μm,与本试验的结果相符。基于仪器扫描的难易程度、扫描耗费时间等考量,本试验中选择显微CT的图像像素尺寸为19.5 μm。在此像素尺寸下,完全可以分辨悬浮载体中的发泡孔。因此,该分辨率下的显微CT图像可以精确地还原悬浮载体的微观孔隙结构,通过仪器直接分析获得的比表面积值也较为准确。

3.3 数学模型计算验证

通过数学模型可进一步验证比表面积计算的准确性。假设气泡孔在悬浮载体(直径30 mm,厚1 mm)的上、下两个表面向内均匀分布,且形状均为圆柱形,圆柱高H<0.5 mm(见图3),圆柱直径为D(mm)。将此问题转化为在平面上圆的密排问题。已有研究表明,六角密堆积方法是最致密的,此时圆面积占比为0.906 9[18]。由于气泡孔的数量足够多,因此本文不再考虑悬浮载体边缘的影响。使用该数据计算这种密排条件下的表面积,则该圆片悬浮载体上最多可容纳的圆柱形孔数量N=(2×1/4×π×30×30×0.906 9)÷(1/4×π×D2)=1 632/D2(个),与悬浮载体上、下表面垂直的区域内的孔的表面积为Sc=H×π×D×N=5 127×H/D(mm2),与悬浮载体上、下表面平行的区域内的孔表面积为:Sp=2×1/4×π×30×30=1 413(mm2),因此孔的总表面积为S=Sc+Sp=1 413+5 127×H/D(mm2)。实际情况下,悬浮载体生产过程中,用于切片的载体棒材始终水平放置,气泡浮力会使气泡拉长,使D大于正球形气泡直径,H小于正球形气泡直径。另外,由于悬浮载体的气泡孔需要与外界接触才能使微生物栖息于内,对于发泡形成的球形,则H

注:a.悬浮载体表面结构,b.六角密堆积及气泡孔直径D,c.圆柱形气泡孔高度H。

图4 H/D示意图

根据以上分析,笔者认为,使用显微CT法测得的比表面积更适用于评估悬浮载体的性能。

4 结论与应用展望

本试验结果显示,与BET气体吸附法相比,使用显微CT法测量不规则多孔悬浮填料省时、省力、准确度较高,可以在实际生产中应用。

另外,利用显微CT可研究细菌细胞。已有研究表明,对于显微CT分辨率的选择,体外研究中,5～10 μm的分辨率可达到细胞水平,但对于体内研究,为提高扫描速度和降低辐照计量,不可避免地会降低空间分辨率[19]。已知细菌细胞的大小为0.5～5.0 μm,一般悬浮载体上的生物膜厚度为23～510 μm[20],目前采用的分辨率能很好地分辨较厚的生物膜。如果将CT的分辨率提高到5～10 μm,甚至是0.5～1.0 μm,将能更好地反映悬浮载体上可供细菌个体栖息的孔径情况,从而获得更为精确的有效比表面积。

由于调小扫描精度会大幅增加显微CT扫描的工作量和工作时长,本试验采用19.5 μm的分辨率检测完整个样品,耗时1.5～2.0 h,如果使用6.5 μm的分辨率,扫描完整个样品,将耗时8～12 h。对于生产过程中快速检测比表面积和挂膜情况时,建议选择19.5～100 μm为显微CT的分辨率,如果要开展更为细致的研究,分辨率可选择1.0～6.5 μm。