三七皂苷血清外泌体对脑出血大鼠炎症损伤干预的研究*

王 鹤 周青云 戴关海 陈 佳#

1 杭州市临平区中医院 浙江杭州 311106

2 浙江中医药大学 浙江杭州 310053

3 浙江省中医药研究院 浙江杭州 310007

脑出血（ICH）是最常见的脑卒中亚型，是脑血管病中极为危重的病变之一，具有较高的致死率和致残率，占卒中的10%～15%[1]。血瘀是贯穿ICH 整个过程的特点，活血化瘀是该病的总治法。三七皂苷（Panax Notoginseng Saponin，PNS）是中药三七的提取物，多项研究表明其对脑缺血再灌注、脑血肿吸收、脑组织及神经损伤修复均有明显疗效[2，3]。但三七皂苷分子量大，脂溶性低，不易透过血脑屏障（blood brain barrier，BBB），影响其药效的发挥[4]。外泌体是一类直径40～160nm 的纳米级囊泡小体，作为信息的载体，可以靶向性传递生物学信息，通过表面粘附蛋白的相互作用转运到周围或者远程的受体细胞从而影响受体细胞的生物功能[5],在炎症、损伤、肿瘤、免疫等疾病治疗方面的作用已被公认，同时，外泌体具有特殊的脂质双层膜结构，可作为治疗药物的载体，高效地透过血脑屏障，更好地发挥中药的疗效[6]。本研究采用自体血注射构建ICH大鼠模型，给予三七皂苷血清外泌体干预，观察其对ICH 大鼠脑组织炎症的影响，为中药治疗ICH 提供新的思路。

1 实验材料

1.1 动物：雄性Wistar大鼠40只，体质量（200±20）g，购自浙江维通利华实验动物技术有限公司，实验动物生产许可证号：SCXK（浙）2021-0006，实验动物使用合格证号：SCXK（浙）2019-0010。本研究经浙江省中医药研究院伦理委员会审批，伦理审批号：浙中研动物伦理审字第〔2022〕049号。

1.2 药物：三七皂苷，购于广西梧州制药股份有限公司。

1.3 主要仪器及耗材：全自动立体定向仪（71000，瑞沃德）、超高速离心机（Optima XPN-100，贝克曼）、透射电子显微镜（JE-OL）、纳米粒径检测仪（ZetaView PMX 110）、Wes 全自动蛋白质印迹定量分析系统（Protein Simple）、Anti-CD63 抗体、Anti-TSG101 抗体和Anti-Hsp70 抗体（abcom），PrimeScript RT reagent Kit 和TB Green Premix Ex Taq Ⅱ（TaKaRa）。Rat IL1β ELISA Assay Kit（Proteintech）、Rat IL-6 ELISA Assay Kit、Rat NF-κB ELISA Assay Kit（CUSABIO）。

2 实验方法

2.1 三七皂苷血清外泌体制备、提取及鉴定：三七皂苷100mg/kg·day 连续腹腔注射7 天后，收集血清。采用经典差数超速离心法获取三七皂苷血清外泌体。离心速度分别为：300×g，4℃，10min 取上清；3000×g，4℃，15min取上清；10000×g，4℃，15min取上清，过0.22μm滤器；继续离心100000×g，4℃，120min，取沉淀重悬至50～200μL PBS 中，此为外泌体混悬液，-80℃冰箱保存备用。通过透射电子显微镜观察外泌体形态、纳米颗粒跟踪分析平台分析外泌体浓度和粒径、全自动Western Blot分析仪检测外泌体标志性蛋白表达。

2.2 脑出血大鼠模型构建及分组：Wistar 大鼠称重，以0.3mL/100g 的10%水合氯醛腹腔麻醉大鼠后将动物俯卧固定在立体定位仪上：沿头皮正中作一长10mm 切口，暴露前囟，定位（前囟前0.2mm，中线右旁开3mm，垂直进针5.5mm为大鼠右侧尾壳核区），用小型牙科钻，钻透颅骨至硬脑膜处；微量注射器穿刺尾动脉，抽取自体动脉血，采用“两次注血法”（进针至尾状核，先注入10µL，停针2min，继续缓慢均匀注入40µL）；局部用医用骨蜡封闭，皮肤逐层缝合；术后大鼠单独饲养，观察自由活动及进食水，根据Zea Longa 评分方法，以评分大于3 分为造模成功。将造模的大鼠随机分成三七皂苷血清外泌体组（三七皂苷血清外泌体，20μg/day）、三七皂苷组（三七皂苷，100mg/kg）、模型组（等体积生理盐水），另设正常大鼠（等体积生理盐水）作为对照组。干预方式均采用尾静脉注射，连续10天。

2.3 指标检测：病理：实验结束，麻醉大鼠后解剖取材，标本为全脑组织。每组取3只大鼠脑组织在福尔马林中充分固定、石蜡包埋及切片，苏木素染色及中性树胶封片，通过光学显微镜观察，采集图像并分析。RT-PCR 检测脑组织中炎症因子核酸水平：使用Trizol 试剂提取脑组织损伤部位总RNA；采用Prime Scrip RT试剂盒逆转录为cDNA；通过TB Green Premix Ex Taq Ⅱ试剂盒检测炎症基因NF-κB、NLRP-3、IL-6、TNF-α 的表达水平。引物委托上海生工生物有限公司设计合成引物，内源性参考基因为β-actin。基因序列为：NF-κB（FTGTGGTGGAGGACTTGCTGAGG；RAGTGCTGCCTTGCTGTTCTTGAG）NLRP-3（FCTGCTGTGCGTGGGACTGAAG；R-AGAACCAATG CGAGATCCTGACAAC）IL-6（F-ACTTCCAGCCAGTTGCCTTCTTG；R-TGGTCTGTTGTGGGTGGTATCCTC）TNF-α（FCACCACGCTCTTCTGTCTACTGAAC；RTGGGCTACGGGCTTGTCACTC）β-actin（FGGAGATTACTGCCCTGGCTCCTA；R-GACTCATCGTA CTCCTGCCTGCTG）。ELISA 检测脑组织匀浆中NF-κB、IL-6、IL1β水平：取脑出血周围组织100mg匀浆处理，按照ELISA试剂盒操作方法检测。

3 统计学方法

数据由SPSS 25 软件处理。各组间计量资料以均数±标准差表示，差异分析比较采用ANOVA单因素方差分析或秩和检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

4 结果

4.1 外泌体鉴定：采用经典的差速超速离心法提取血清外泌体，通过透射电子显微镜检测呈典型的双层脂膜的类圆形囊泡结构（见图1A）；纳米颗粒追踪分析（NTA）实验显示直径为113.1nm 外泌体的比例为96.6%，颗粒浓度为2.8×1010个/mL（见图1B）；全自动Western Blot蛋白表达分析仪分析结果显示外泌体特征性标志蛋白TSG101、CD63、Hsp70 均呈阳性表达（见图1C）。证实所提取的微囊泡为血清外泌体。

图1 外泌体鉴定结果

4.2 对各组脑组织病理影响：对照组的脑组织结构完整，无炎性细胞浸润；模型组出血部位脑组织结构严重紊乱，可见大量红细胞，炎症细胞浸润严重，水肿明显；三七皂苷组及三七皂苷外泌体组脑出血部位表现红细胞及炎症细胞呈不同程度的减少，以三七皂苷血清外泌体组最为显著。见图2。

图2 脑组织病理结果（HE染色，200×）

4.3 对脑出血损伤周围组织中炎症核酸水平表达影响：RT-PCR 结果显示，与对照组比较，模型组脑出血周围脑组织中炎症因子NF-κB、NLRP-3、IL-6、TNF-α mRNA 因子核酸水平表达明显上调，而经过三七皂苷及三七皂苷血清外泌体治疗后，两组的炎症因子NF-κB、NLRP-3、IL-6、TNF-α mRNA 均有下调，其中，三七皂苷血清外泌体组的作用效应显著优于三七皂苷组。见表1。

表1 三七皂苷血清外泌体对脑组织中炎症因子mRNA表达的影响（±s，2-△△ct）

表1 三七皂苷血清外泌体对脑组织中炎症因子mRNA表达的影响（±s，2-△△ct）

注：与对照组比较，*P＜0.05；与模型组比较，#P＜0.05。

分组对照组模型组三七皂苷组三七皂苷血清外泌体组n6 6 6 6 NF-κB 1.33±0.19#4.83±1.62*3.07±1.22*1.55±0.35#NLRP-3 1.56±0.34#3.00±0.94*2.61±0.53*1.95±0.30#IL-6 1.74±0.63#3.16±1.08*2.94±1.16*1.93±0.66#TNF-α 0.59±0.35#1.62±0.19*1.28±0.26*0.73±0.13#

4.4 对脑出血损伤周围组织中炎症蛋白水平表达影响：ELISA 结果显示，与对照组比较，模型组脑出血周围脑组织中NF-κB、IL-1β及IL-6含量显著增加。经过三七皂苷及三七皂苷血清外泌体治疗后，两组的NF-κB、IL-1β及IL-6含量均明显降低，其中，以三七皂苷血清外泌体组下降最为显著。见表2。

表2 三七皂苷血清外泌体对脑组织中炎症因子蛋白水平影响（±s，pg/mL）

表2 三七皂苷血清外泌体对脑组织中炎症因子蛋白水平影响（±s，pg/mL）

注：与对照组比较，*P＜0.05；与模型组比较，#P＜0.05。

分组对照组模型组三七皂苷组三七皂苷血清外泌体组n6 6 6 6 NF-κB 1.41±0.35#3.97±0.67*3.02±0.55*1.97±0.51#IL-1β 31.35± 8.17#102.50±16.15*77.32±15.33*46.15±15.84#IL-6 33.08±5.70#75.53±7.36*55.20±3.88*39.32±3.94#

5 讨论

研究显示ICH 逐年增高的发病率，高昂的医疗费用，患者劳动及自理能力的缺失，造成了我国严重的社会和家庭负担，早期有效的防治是减少并发症的有效手段[7]。ICH 是一种出血性卒中，其特征是血管中的血液破入脑实质，ICH 发生后，局部中枢系统和全身免疫应答相继被激活，血肿、促炎症反应及氧化应激等造成了脑组织损伤[8]。促炎症细胞因子NF-κB、NLRP-3、TNFα和IL-6等增加以及白细胞浸润导致内皮和细胞外基质的功能障碍，与脑损伤和长期残疾密切相关[9，10]。促进血肿吸收，减轻炎症水平对脑组织及神经系统恢复极为重要[11]。

ICH 中医上归属于中风范畴，病位在脑，由于多种因素导致血行滞缓，脑血脉运行不畅，血溢出脉外，瘀阻脑络而病。故从形态学及病理学上不难得出“瘀血”为该病常见证型[12]。针对血瘀证，要以活血化瘀为其主要治疗方法。三七素有“止血不留瘀，活血不伤正”的美名，为伤科用药之首选。在神经系统疾病治疗血瘀证有着一定的临床基础。本研究着眼于脑组织炎症及病理改善，采用三七有效成分三七皂苷制备血清外泌体，在治疗形式上是一种创新。通过研究发现，三七皂苷血清外泌体可更好地改善脑出血导致的血肿、炎症、损伤等，这与外泌体在治疗神经系统疾病相关研究的结果一致[5]。这可能与其跨血脑屏障的治疗药物的输送，更好发挥脑组织内药效有关。为中药治疗神经系统疾病提供了新手段。

综上，本研究表明三七皂苷血清外泌体作为生物活性物质可有效改善大鼠脑出血后脑组织炎症水平，缓解病理损伤，对脑出血损伤具有一定保护作用。