结核性胸膜炎患者胸腔积液M1/M2巨噬细胞比例与预后

沈晨阳，俞洪霞，余建平

浙江大学医学院附属第二医院临平院区感染科，浙江杭州 311100

结核性胸膜炎（tuberculous pleurisy，TP）指因结核分枝杆菌及其代谢产物入侵高敏状态下的胸膜腔，导致纤维蛋白、炎症细胞等大量渗出，临床多见于中青年人群，主要表现为发热、盗汗、消瘦等结核中毒症状与胸腔积液引发的局部压迫症状[1-2]。多数患者经胸腔闭式引流及积极抗结核治疗后，胸腔积液常在1 个月内消失，临床症状缓解；而部分患者虽经治疗后仍出现胸膜增厚、胸腔粘连及胸腔积液吸收不完全等问题，进而引发支气管扩张，致使患者肺功能下降，影响其生存质量及预后[3]。因此，临床急需寻找一个高度特异性及敏感度的指标，以评估TP 患者治疗预后。巨噬细胞在TP 的发生及发展中起重要作用，是恶性胸腔积液及结核性胸腔积液中共有的细胞成分，其中M1 巨噬细胞可增强细胞的免疫活性，M2 巨噬细胞则能够负向调控免疫反应[4]。Pan 等[6]研究显示，M1/M2 巨噬细胞表达失衡与炎症反应的发展与转归密切相关，是多种疾病鉴别诊断的免疫学标志物。但目前M1/M2 比例与TP预后的相关报道较少，故本研究拟分析TP 患者单核细胞中M1/M2 巨噬细胞比例与TP 预后关系，以期为临床对TP患者的预后判断及相关防治措施的制定提供参考。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2019 年6 月至2022 年12 月浙江大学医学院附属第二医院临平院区诊治的TP 患者206 例为研究对象，其中男性128 例，女性78 例；年龄31～78岁，平均年龄为（55.78±11.51）岁；体质量指数（body mass index，BMI）为（19.81～25.33）kg/m2，平均BMI为（23.07±1.78）kg/m2；发病至就诊时间为14～46d，平均发病至就诊时间为（31.15±10.67）d。纳入标准：①符合《结核病实验室检验规程》[6]中TP 的相关诊断标准；②初次确诊，且入组前未接受过相关治疗；③年龄不低于18 岁；④入组前未接受氟喹诺酮类抗生素治疗；⑤病历及随访资料完整。排除标准：①长期接受免疫抑制剂治疗；②伴有其他细菌感染性疾病；③合幵神经、免疫和血液系统疾病；④伴有严重的心脏、肝脏、肺等重要脏器疾病。本研究通过浙江大学医学院附属第二医院医学伦理委员会批准（伦理审批号：伦审研20190620003），患者均签署知情同意书。

1.2 方法

1.2.1 M1 和M2 巨噬细胞表达水平检测 所有患者入院时均检测其胸腔积液中M1 和M2 巨噬细胞表达水平[7-8]：①入院时，抽取患者胸腔积液10ml，幵置于肝素抗凝管内；②采取密度梯度离心法分离胸腔积液内的单核细胞：将采集的胸腔积液，以1500r/min，离心10min，吸取下层的细胞沉淀与磷酸盐缓冲液（phosphate buffer solution，PBS）均匀混合后，将其小心、缓慢加入到Ficoll 分离液表面（切勿搅动），以2500r/min 离心20min 后，使用移液管将中间“云雾层”的单核细胞仔细、小心地抽出，再加入PBS 溶液，以1500r/min 离心10min 后，底层沉淀即为研究所需的胸腔积液单核细胞（mononuclear cells in pleural effusion，PFMC），使用PBS 溶液将所得的PFMC 洗涤2 次，以进行纯化，之后在液氮中储存；③常规复苏PFMC，置于含有10%胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）的RP-MI1640细胞培养液中，在37℃、5% CO2的恒温培养箱中培养30min，取出，将细胞密度调节到1×105个/ml，吸取2ml 置于流式管，以800r/min 离心5min 后，弃去上清液，幵加入0.1ml 的PBS 重悬细胞，以抗人F4/80-APC、抗人CD86-FITC与抗人CD206-PE/Cy5.5标记巨噬细胞，于4℃下避光培养30min，加入2 ml的PBS 洗涤细胞，以800r/min 离心10min 后，弃去上清液，幵加入0.2ml 的PBS 重悬细胞，混匀后使用0.22μm 的滤膜过滤，然后使用FACS Vantage SE流式细胞仪进行检测分析，F4/80+CD86+为M1 巨噬细胞的表面分子标志物，F4/80+CD206+为M2 巨噬细胞的表面分子标志物，M1 和M2 巨噬细胞表达水平以阳性细胞比例表示。

1.2.2 预后判断分组 所有患者出院后随访6 个月，采用胸部彩超检查患者胸膜增厚及胸腔积液吸收情况。胸膜增厚：胸膜最厚处>3mm，胸腔积液吸收较差：胸腔积液最深处>5mm；胸膜增厚且胸腔积液吸收较差者提示预后不良（n=47）纳入预后不良组，反之则提示预后良好（n=159）纳入预后良好组[9]。

1.2.3 资料统计 收集可能导致TP 患者预后不良的相关因素：性别、年龄、BMI、发病至就诊时间、吸烟、饮酒、糖尿病、胸腔积液部位、合幵肺结核、结核菌感染T 细胞斑点试验（T-spot）结果、感染耐药菌、胸腔积液量、胸腔积液蛋白、白细胞计数（white blood cell，WBC）、红细胞沉降率（erythrocyte sedimentation rate，ESR）、乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase，LDH）、M1 及M2 巨噬细胞表达水平、M1/M2 巨噬细胞比例。

1.2.4 观察指标 ①单因素分析可能影响TP 患者预后的相关因素；②多因素Logistic 回归分析影响TP患者预后的危险因素；③受试者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲线评估M1/M2 巨噬细胞比例对TP 患者预后不良的预测价值。

1.3 统计学方法

采用SPSS 24.0 统计学软件进行数据分析，计量资料以均数±标准差(±s)表示，以独立样本t检验进行比较，计数资料以例数（百分率）[n（%）]表示，以χ2检验进行比较，多因素Logistic 分析明确影响TP 患者预后的危险因素，绘制ROC 曲线评估M1/M2 巨噬细胞比例对TP 患者预后不良的预测价值。以P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 单因素分析可能影响TP 患者预后的相关因素

两组患者性别、年龄、BMI、吸烟、饮酒、糖尿病、高血压、合幵肺结核与否、T-spot 试验结果、胸腔积液量、胸腔积液蛋白、WBC、LDH 比较（P>0.05）。相较于预后良好组，预后不良组因延误最佳诊疗时间，患者发病至医院就诊时间明显更长，感染耐药菌占比、ESR、M1 及M2 巨噬细胞表达水平明显更高，M1/M2 巨噬细胞比例明显更高，向M1 型极化增多（P<0.05），见表1。

表1 单因素分析可能影响TP 患者预后的相关因素

2.2 多因素Logistic 回归分析影响TP 患者预后的危险因素

经多因素Logistic 回归分析显示，发病至就诊时间、感染耐药菌、ESR、M1 及M2 巨噬细胞表达水平、M1/M2 巨噬细胞比例是影响TP 患者预后不良的危险因素（P<0.05），见表2。

表2 多因素Logistic 回归分析影响TP 预后的危险因素

2.3 M1/M2 巨噬细胞比例对TP 患者预后不良的预测价值

ROC 曲线分析结果显示，M1 及M2 巨噬细胞表达水平预测TP 患者预后不良的曲线下面积分别为0.783、0.829，敏感度分别为70.45%、81.47%，特异性分别为79.62%、73.44%，M1/M2 巨噬细胞比例预测TP 患者预后不良的AUC 为0.921、敏感度为92.59%、特异性为84.96%，均明显大于二者单独预测（P<0.05），见图1。

图1 M1/M2 巨噬细胞比例对TP 患者预后不良的预测价值ROC 曲线分析

3 讨论

结核性渗出性胸膜炎发病急剧，患者常表现为持续数日甚至数周的高热，其体温高低与胸腔积液细胞数和胸腔积液量常呈正比，同时常伴有盗汗、消瘦等结核中毒症状，且随胸腔积液增多，患者可出现明显的胸闷气急等症状[10]。早期就诊，有助于临床及时通过胸腔穿刺抽液和注入尿激酶等药物溶解纤维蛋白，有利于胸腔闭式引流胸腔积液，减少蛋白沉积粘连于胸膜表面，造成胸膜对胸腔积液的吸收能力下降而导致胸膜增厚、胸膜粘连引发呼吸困难的机会。部分患者接受治疗后，仍会出现不同程度的胸膜增厚及胸腔积液反复等，影响TP 患者生活质量[11-12]。

本研究通过多因素Logistic 分析显示，发病至就诊时间、感染耐药菌、ESR、M1 及M2 巨噬细胞表达水平、M1/M2 巨噬细胞比例是影响TP 患者预后不良的危险因素，这与Yan 等[13]研究一致。分析其原因，在炎症、病理情况下ESR 可明显加快，故测定ESR 有助于临床了解TP 病情进展，但临床多联合腺苷脱氨酶（adenosine deaminase，ADA）等检测结果共同分析[14]。而感染耐药菌的患者，对药物的敏感度降低，导致部分药物的疗效降低，甚至于无效，增加临床治疗难度，影响临床疗效及预后。巨噬细胞是结核分枝杆菌感染的第一道防线，结核分枝杆菌感染可刺激巨噬细胞生成多种细胞因子，以提高巨噬细胞自身的免疫应答能力，激活T 细胞，分泌促炎因子，从而进一步激发巨噬细胞活性[15-16]。激活的巨噬细胞可极化为M1与M2 两种形态，其中经典激活途径下活化的巨噬细胞为M1 巨噬细胞，可增强吞噬杀菌、促进炎症反应活性，激活多种促炎因子，启动适应性细胞免疫应答，以清除病原体；替代激活途径下活化的巨噬细胞为M2 巨噬细胞，可抑制炎症反应，能合成、分泌抑炎因子，促进体液免疫应答，加速组织的再生和修复[17]。大量巨噬细胞向M1 型极化可增强吞噬杀菌功能，促进炎症反应活性，导致机体免疫处于超敏状态，可炎性刺激胸膜，导致纤维蛋白组织大量增生、沉淀，出现胸膜增厚、板层胸膜、胸膜钙化，严重损害患者的肺功能[18]。Wu 等[19]研究显示，M1/M2 巨噬细胞表达失衡、向M1 型极化增多可加重机体炎症反应，促使疾病进一步恶性发展，影响TP 患者预后。

此外，本研究中M1 及M2 巨噬细胞表达水平预测TP 患者预后不良的AUC 分别为0.783、0.829，敏感度分别为 70.45%、81.47%，特异性分别为79.62%、73.44%，而M1/M2 巨噬细胞比值预测TP患者预后不良的AUC 为0.921、敏感度为92.59%、特异性为84.96%，均明显大于二者单独预测价值。分析其可能原因：M1 和M2 巨噬细胞在胸腔积液巨噬细胞中所占比例各有差异，试验方法和标志物的选择对检测结果有较大的影响，导致检测结果的重复性较差；而检测M1/M2 巨噬细胞比例，可有效降低实验数据偏差，重复性高，预测价值较高。孙峰等[20]采用流式细胞术检测抗结核治疗前后胸腔积液中M1 与M2 巨噬细胞，治疗后M1、M2 巨噬细胞均较治疗前增多，但M2 转化增高更明显，M1/M2比值显著降低，提示M1/M2 巨噬细胞比例高对TP患者预后不良的预测价值更高，且具有较高的特异性与敏感度，与本研究结果一致。

综上所述，发病至就诊时间、ESR、M1 及M2巨噬细胞表达水平、M1/M2 巨噬细胞比例等均与TP患者预后不良密切相关，其中M1/M2 巨噬细胞比例高对TP 患者预后不良的预测价值更高，更有助于临床判断TP 预后，及时制定幵实施相关防治措施，从而改善临床治疗效果及预后，提高患者生存质量。