硫辛酸烟酸二联体对蓝光致大鼠视网膜损伤的防治作用

程天豪,邹玉平,简柳连,章梦一,豆艺璇

0引言

随着新型光照,如手机、高功率显示器、诊疗仪器等的出现,人眼接触大剂量蓝光机会日益增多[1]。蓝光在可见光中波长最短,但能量较高,能通过角膜与晶状体达到视网膜[2-3],即使在低照度的情况下,蓝光就能引起N-视黄酰亚烯-N-视黄醇胺(N-retinylidene-N-retinylethanolamine,A2E)在视网膜中堆积[4]、活性氧增加[5]等变化,最终导致光化学损伤,这是引起年龄相关性黄斑变性(age-related macular degeneration,ARMD)等视网膜退行性变疾病[6-7]的发病诱因之一。蓝光视网膜损伤的机制十分复杂,在细胞层面上,已有较多学者开展了相关研究,据以往报道,氧化应激在此环节中扮演着极为重要的角色[8-9],在我们团队前期的研究中发现蓝光通过氧化应激途径激活Bax/Bcl-2凋亡通路导致视网膜色素上皮细胞损伤[10]。α-硫辛酸(alpha lipoic acid,ALA)和烟酸(niacin)被认为是高效的抗氧化剂,同时具有神经保护作用。烟酸和ALA形成的新型复合物,被命名为硫辛酸烟酸二联体(lipoic acid-niacin,N2L),该复合物的生物利用度更高,更易穿过血-脑屏障,药物代谢更快,较烟酸和ALA的副作用更少[11]。在我们团队既往的研究中发现N2L可以防止细胞受到氧化应激引起的损伤[12],上调Bcl-2同时抑制Bax表达从而保护人视网膜色素上皮细胞(ARPE-19)[13],但该药物缺乏在体内实验相关研究,需进一步探寻其药物效果及最佳剂量。本实验首次将N2L应用于大鼠,旨在探讨N2L对蓝光暴露下大鼠视网膜损伤的保护作用,并探索其保护机制,以期为临床防治蓝光视网膜损伤提供新的理论依据和防治策略。

1材料和方法

1.1材料

1.1.1实验动物36只5周龄雄性SPF级SD大鼠,体质量150-200 g,由广州红萝卜生物科技有限公司提供(许可证号:SCXK 2021-0059)。给予充足的食物与水,在12 h明暗交替环境下饲养。应用随机数字表法将36只SD大鼠随机分为6组,每组6只大鼠。分别为正常对照组、蓝光损伤组、N2L低剂量组(1.0 mg/kg)、N2L中剂量组(2.5 mg/kg)、N2L高剂量组(5.0 mg/kg)及生理盐水组。本研究动物的使用和喂养遵循美国视觉与眼科学研究协会制定的ARVO声明(审批号:SYDW2022108)。

1.1.2主要试剂与仪器硫辛酸烟酸二联体(中山大学药学院);蓝光灯板(中山共炫光电科技有限公司);复方托吡卡胺滴眼液(沈阳市兴齐制药有限责任公司);透明质酸钠凝胶(广州铭安生物科技有限公司);Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody(Cell Signaling Technology,1∶1000);GAPDH(D16H11)XP®Rabbit mAb(Cell Signaling Technology,1∶1000);Caspase-3(D3R6Y)Rabbit mAb(Cell Signaling Technology,1∶1000);NQO1(D6H3A)Rabbit mAb(Cell Signaling Technology,1∶1000);Bax Antibody(Affinity,Rabbit,1∶1000);Bcl-2 Antibody(Affinity,Rabbit,1∶1000);GST(91G1)Rabbit mAb(Cell Signaling Technology,1∶1000);AffinityTMECL kit(picogram);HE染色液(北京索莱宝科技有限公司);罗兰电生理仪(德国罗兰公司);角膜接触镜电极(北京高视远望科技有限公司);CheKineTM超氧化物歧化酶(SOD)活性检测试剂盒(Abbkine);BX-51显微镜(日本Olympus公司);冷冻研磨仪(广州露卡测序仪器有限公司);酶标仪(美国赛默飞世尔科技公司);凝胶成像分析仪与电泳仪(美国伯乐公司);生物安全柜(青岛海尔生物医疗股份有限公司)。

1.2方法

1.2.1实验动物蓝光视网膜损伤造模正常对照组大鼠饲养于12 h/12 h正常光照/黑暗环境中,低、中、高剂量组及生理盐水组每日9∶00腹腔注射1 mL对应药物(按体质量用0.9%NaCl溶液稀释),分别为1.0 mg/kg N2L、2.5 mg/kg N2L、5.0 mg/kg N2L及0.9% NaCl溶液,11∶00位进行蓝光照射,照射前15 min双眼滴复方托吡卡胺散瞳,待散瞳后将大鼠暴露于LED蓝光灯板(光照强度3000±50 lx,波长455 nm)下3 h,连续14 d。造模装置包括箱顶的盖状55.5 cm×36.5 cm蓝光灯板(由24×48个均匀分布LED蓝光灯组成),箱体为55 cm×36 cm×40 cm透明亚克力板构成的鼠笼,中间以“田”字形透明隔板隔开,周围包裹锡纸,每个隔间放置1只大鼠。大鼠在蓝光暴露下出现疲惫状态,需每10-20 min唤醒1次。

1.2.2ERG法评估大鼠视网膜功能蓝光辐照完成后将大鼠正常饲养5 d再进行该项检测以达到最佳损伤变化[14]。检测前将各组大鼠置于暗室至少24 h。暗室微弱红光源下检查,以0.3 mL/100 g腹腔注射10%水合氯醛,双眼滴复方托吡卡胺散瞳,静置15 min。固定四肢于自制保暖活动床上,将3根针电极分别连接于两侧眼下5 mm和尾根部皮下,双眼角膜涂抹适量甲基纤维素钠,万向轴固定环形金电极轻柔贴附于角膜表面。打开RETI port ERG(视网膜电图,electroretinogram)软件,暗视0.01 (cd·s)/m2强度(极低亮度)刺激光,记录3次,间隔2 s;3.0 (cd·s)/m2强度(中亮度)刺激光,记录3次,间隔10 s;10.0 (cd·s)/m2强度(高亮度)刺激光,记录3次,间隔10 s。暗视震荡电位(oscillatory potentials,OPs),记录3次,3.0 (cd·s)/m2,闪烁光频率30 Hz,10次叠加平均,间隔15 s。明视采用25 (cd·s)/m2曝光10 min,以3.0 (cd·s)/m2刺激光进行刺激,记录3次,间隔10 s。导出数据后测量ERG b波及OPs震荡电位第2个波峰(OS2)振幅及ERG b波及OPs震荡电位第2个波谷(P2)潜伏期。完成检查后双眼滴适量氧氟沙星眼膏。

1.2.3取材将各组大鼠注射过量10%水合氯醛处死,摘取一侧眼球,于12∶00位及3∶00位黑色纹身染料标记,置于4%多聚甲醛固定。摘取另一侧眼球,冰上操作,在预冷至0 ℃的PBS缓冲液中,用组织剪沿角膜缘剪去角膜,去除晶状体,显微镊沿锯齿缘轻柔钝性分离视网膜,最后分离视神经部位较紧密连接处。取得的组织置于冻存管内保存在液氮中,1 h后转移至-80 ℃冰箱保存待后续使用。

1.2.4HE染色检测视网膜厚度固定24 h于4%多聚甲醛,逐级乙醇脱水,常规石蜡包埋,平行于视神经进行切片,厚度3 μm,苏木精-伊红(HE)染色,在BX-51光学显微镜下观察外核层(outer nuclear layer,ONL)的厚度,利用计算机图像分析系统测量,以此作为光感受器丧失的判断指标。

1.2.5超氧化物歧化酶测试盒检测SOD表达采用CheKineTMSOD活性检测试剂盒进行SOD活性检测,将冻存于-80 ℃冰箱的视网膜研磨至均匀粉状,取视网膜组织(每组约30 mg冰冻研磨混匀粉状视网膜组织)与溶解缓冲液溶液按照1 mg∶10 μL冷冻研磨仪上按照-65 ℃、75 Hz持续30 s、暂停20 s运行4个循环匀浆,完成后置于低温离心机4 ℃,12000 g离心5 min,取上清液检测。按说明书分别配制体积为120 μL的样本孔、样本对照孔、空白孔及空白对照孔,混匀加入96孔板,37 ℃孵育30 min,酶标仪测定450 nm处吸光度,记录数据后按如下公式计算得出结果:SOD活性(U/g)=6×抑制百分率/(1-抑制百分率)/W(样本质量)×n(稀释倍数)。

1.2.6WesternBlot检测相关蛋白的表达取视网膜组织(每组约50 mg冰冻研磨混匀粉状视网膜组织)和RIPA裂解液按1 mg∶10μL混合后于冷冻研磨仪上按照-65 ℃、75 Hz持续30 s、暂停20 s运行4个循环匀浆,冰上孵育30 min后,于低温离心机4 ℃,12000 g离心15 min获取蛋白。BCA蛋白定量后,在SDS-PAGE上进行电泳,转移至PVDF膜上,室温下5%牛血清白蛋白封闭60 min,置于摇床40 r/min,加入GAPDH、Caspase-3、谷胱甘肽巯基转移酶(GST)、醌氧化还原酶1(NQO1)、Bax、Bcl-2及NQO1抗体(通用型抗体稀释液1∶1000)4℃孵育过夜,TBST洗涤3次,Anti-rabbit IgG(通用型抗体稀释液1∶1000)室温孵育90 min,摇床40 r/min,洗涤3次。避光下ECL显影,采用凝胶成像仪拍照,Image J测定各条带灰度值并比较。重复3次,计算平均值。

2结果

2.1各组大鼠视网膜ONL厚度比较相较正常对照组,长时间蓝光辐照可明显降低大鼠视网膜ONL层厚度,观察视盘中心偏颞侧400 μm位置(图1)。正常对照组、蓝光损伤组、N2L低剂量组、N2L中剂量组、N2L高剂量组及生理盐水组大鼠视网膜ONL层厚度分别为34.4±3.24、25.6±3.45、29.5±2.58、33.1±3.97、28.3±2.96、27.0±2.34 μm,各组大鼠视网膜ONL层厚度差异有统计学意义(F=10.382,P<0.001)。与正常对照组比较,蓝光损伤组、N2L低、高剂量组ONL厚度下降(P<0.001,P=0.025,P=0.004),正常对照组与N2L中剂量组ONL厚度无显著变化(P=0.961);N2L中剂量组ONL厚度明显高于蓝光损伤组及N2L高剂量组(P<0.001,P=0.017)。

图1 各组大鼠视网膜外核层厚度比较 GCL:神经节细胞层;IPL:内丛状层;INL:内核层;OPL:外丛状层;ONL:外核层;IS:光感受器内节。aP<0.05,bP<0.01 vs N2L中剂量组;cP<0.05,dP<0.01 vs 正常对照组。

2.2各组大鼠ERG波形比较各组暗视ERG b波不同刺激光强度及震荡电位P2潜伏值均无显著差异。暗视ERG b波极低亮度刺激光振幅各组无显著差异;中亮度刺激光下,蓝光损伤组振幅显著低于正常对照组(P=0.016),N2L中剂量组振幅高于蓝光损伤组(P=0.022);高亮度刺激光下,蓝光损伤组、N2L低剂量和高剂量组振幅低于正常对照组(P<0.001,P=0.001,P=0.008),N2L中剂量组振幅高于蓝光损伤组(P=0.003);蓝光损伤组及N2L低剂量组震荡电位OS2振幅低于正常对照组(均P<0.001),N2L中剂量和高剂量组振幅高于蓝光损伤组(P<0.001,P=0.010),N2L中剂量组高于N2L低剂量组(P=0.004),见表1,图2。各组明视ERG b波潜伏值无显著差异;蓝光损伤组振幅显著低于正常对照组(P<0.001),N2L中剂量和高剂量组高于蓝光损伤组(P<0.001,P=0.001),N2L中剂量高于N2L低剂量组(P=0.003),见表2。

表1 各组大鼠暗视ERG b波与OPs P2潜伏值、b波与OPs OS2振幅比较

表2 各组大鼠明视ERG b波潜伏值与振幅比较

图2 各组大鼠视网膜蓝光损伤后暗视ERG波形变化 A:强度0.01 (cd·s)/m2(Scot 0.01);B:强度3.0 (cd·s)/m2(Scot 3.0);C:强度10.0 (cd·s)/m2(Scot 10.0);D:强度3.0 (cd·s)/m2(OPs)。

2.3各组大鼠视网膜SOD表达量比较正常对照组、蓝光损伤组、N2L低剂量组、N2L中剂量组、N2L高剂量组及生理盐水组大鼠视网膜SOD活性分别为52.09±4.82、58.64±3.10、66.19±2.27、72.38±3.57、62.23±2.69、57.72±2.59 U/g,各组比较差异有统计学意义(F=37.32,P<0.001)。蓝光损伤组大鼠视网膜SOD活性稍高于正常对照组(P=0.017);N2L低、中剂量组SOD活性增加相较蓝

光损伤组更明显(P=0.001,P<0.001),N2L中剂量组增加程度较N2L低、高剂量组更明显(P=0.006,P<0.001)。

2.4各组大鼠视网膜各蛋白表达量比较蓝光损伤组Caspase-3蛋白表达量高于正常对照组(P<0.001),N2L低、中、高药物组表达量均显著低于蓝光损伤组(均P<0.001),N2L中、高剂量组较N2L低剂量组表达量更低(均P<0.001);N2L低、中、高剂量组GST蛋白表达量均显著高于蓝光损伤组(均P<0.001),N2L低、中剂量组高于N2L高剂量组(P=0.019,P=0.002);蓝光损伤组NQO1蛋白较正常对照组轻度升高(P=0.002),N2L低、中剂量组高于蓝光损伤组(P=0.005,P=0.016);蓝光损伤组Bax表达量显著高于正常对照组(P=0.001),N2L低、中、高剂量组低于蓝光损伤组(P<0.001,P<0.001,P=0.001),N2L中剂量组低于N2L低、高剂量组(P=0.031,P=0.030);蓝光损伤组Bcl-2表达量与正常对照组无显著差异(P=0.782),N2L中剂量组表达量高于蓝光损伤组及N2L低剂量组(P=0.002,P=0.021);N2L中剂量组Bcl-2/Bax明显高于正常对照组、蓝光损伤组、N2L低剂量组、N2L高剂量组和生理盐水组(P<0.001,P<0.001,P=0.001,P=0.004,P<0.001),见表3,图3。

表3 Western blot检测法检测各组大鼠视网膜凋亡及保护性蛋白相对表达量

图3 各组大鼠视网膜各蛋白表达量。

3讨论

蓝光视网膜损伤的主要途径之一是诱导组织的氧化应激反应[2]。ALA和烟酸是高效的抗氧化剂且具有神经保护作用[11],然而,ALA在组织中含量有限且脂溶性较差,两种药物均可能引起血管扩张导致的面色潮红以及恶心、腹泻和尿道炎等副作用。有报道证实,与其他药物联合使用时,烟酸的活性可以增强,副作用可以减弱[15]。烟酸和ALA形成的新型复合物,被命名为硫辛酸烟酸二联体(N2L)。该复合药物的生物利用度更高,更易穿过血脑屏障,代谢更快且副作用更少[11,15]。2013年王观峰等[12]学者探讨了N2L对氧化应激诱导的ARPE-19损伤的保护作用,研究发现该药物可以显著增加细胞活性,防止细胞肿胀、变性、坏死,抑制凋亡小体的形成;2014年邹秀兰等[13]学者发现N2L对ARPE-19细胞的保护作用机制是通过激活抗凋亡蛋白Bcl-2并抑制Bax的表达。

既往N2L相关研究集中于细胞层面[12-13],该药物的实际防治效果需要进一步完善。本研究首次将N2L用于大鼠蓝光损伤模型的防治研究,通过ERG检查评估了大鼠的视网膜功能,初步探索了该药物对视网膜的保护作用及适宜剂量。为了解决预实验中出现的大鼠模型双眼损伤差异及各组照射强度差异,本研究采用了大面积蓝光灯板以提高光线的均匀度,更类似日常暴露于发光二极管的情况;灯板定制增加了滑动变阻器调控光线强度,将光照强度误差控制低于1.7%;自制了透明亚克力鼠笼并用透明隔板隔开每只大鼠,以防其堆叠导致的损伤差异。

ONL属于感光细胞层,在受到损伤时往往会出现厚度降低,视杆细胞与视锥细胞的数量下降[16],进而导致视觉敏感度下降、视野缺失和色觉异常等问题。ERG能通过检测微电流以反映视网膜各细胞、组织的健康水平[17],b波主要反映双极细胞和Müller细胞的功能[18],其振幅的下降代表光线在神经感觉层的传导受到影响。在我们的实验中,与正常对照组基线水平相比,蓝光损伤组ERG b波在中、高强度刺激光下振幅显著降低,ONL厚度明显变薄,这与其他学者蓝光损伤的造模结果相符[3,14]。生理盐水组各项检查结果与蓝光损伤组无显著差异(生理盐水组除注射物质不同以外其余操作均与各剂量药物组保持一致),确保了防治效果来自于药物本身而非试验操作。

SOD活性反映了组织抗氧化损伤能力的强弱。Caspase-3是Caspase家族成员导致细胞凋亡的最终执行者[6];NQO1及GST属于抗氧化蛋白,接受上游Nrf2、PKC等蛋白调控[3,19-20];Bax和Bcl-2是凋亡调控中功能对立的一对重要基因,其相对比例对细胞凋亡有重要影响,Bax相对高表达时启动凋亡,而Bcl-2相对高表达时对抗其诱导凋亡的作用,延长细胞存活期[21]。连续的蓝光照射会导致组织无法及时清除活性氧(ROS),加重氧化应激损伤的同时抑制RPEc中溶酶体吞噬光感受器细胞的ROS,引起脂褐质的堆积[22-23],脂褐质中含有的A2E对蓝光极为敏感,进一步引起RPEc凋亡、线粒体DNA功能障碍及氧化应激反应加重的恶性循环[23-24]。我们观察到,应用N2L使SOD活性增加,GST、NQO1及Bcl-2的表达升高,这或许能够阻断A2E堆积等情况的发生。此外,该药物降低了Caspase-3及Bax的表达,将正常对照组Bcl-2/Bax的比值作为判断细胞凋亡或增殖趋势的平衡状态,蓝光损伤组比值小于1,而N2L各剂量组的比值均大于1。因此,我们推测N2L降低氧化应激损伤的同时增加细胞的增殖速率,减少凋亡的同时更好地保留视网膜功能,HE染色和ERG检测中的结果也印证了这一点。各剂量N2L组ONL厚度高于蓝光损伤组,暗视ERG中、高强度刺激光下b波、震荡电位OS2及明视ERG b波振幅显著高于蓝光损伤组,其中2.5 mg/kg浓度的N2L药物效果最佳,能更为有效地减少蓝光引起的视网膜损伤,保留视觉功能,降低蓝光引起的敏感度、视野和色觉上的损伤。

我们推测,更高剂量的N2L可能由于其内含有的烟酸成分会导致血糖控制紊乱[25],这可能会加重视网膜组织的炎症反应,进而促进蓝光损伤并使损伤难以得到控制,ROS无法及时清除[26]。因此,N2L浓度与疗效并非完全正相关。对于这一有趣的现象我们需要今后设置更大样本量、浓度分层更多的实验来加以探究。同时我们发现,N2L能增加多种抗氧化蛋白的表达,拮抗蓝光导致的氧化应激损伤,结合其他学者的实验结论,这或许与其上游蛋白Nrf2/AREs通路相关[27-28],其机制需要进一步验证。该复合药物起效过程中,各药物成分对蓝光防治效果的贡献度及药效作用是否有叠加等问题也是我们团后续研究的方向之一。此外,该实验造模阶段采用的是大鼠散瞳后整体照射,以使得空间内的光照强度均匀而不受大鼠活动影响,视网膜损伤范围较未散瞳更大。然而,皮肤受蓝光照射或许会对实验结果产生一定影响,配置动眼跟随系统或覆盖大鼠皮肤后再进行造模也许能够避免该问题。

综上,本研究探讨了N2L对大鼠蓝光视网膜损伤的防治作用和适宜剂量,初步探索了该药物保护机制,为进一步研究其相关信号通路以及临床蓝光损伤提供了新的理论依据和防治策略。