姜精油和柠檬醛对生姜枯萎病菌的抑菌作用及盆栽防效*

周丽荣 ,熊诗洁 ,张玲玲 ,马慧慧 ,朱学栋 ,尹军良 ,刘奕清**

(1.长江大学园艺园林学院/香辛作物研究院 荆州 434025;2.重庆市渝东南农业科学院 涪陵 408013;3.长江大学农学院 荆州 434025)

生姜(Zingiber officinale)是姜科姜属的多年生草本植物,除了作为香料和调味品,因其具有抗菌、抗炎、解热、抗氧化、降血糖、保肝和利尿的特性[1-2],它是传统中药材。近年来,生姜的供需不断增加,但生姜的年产量却受到病毒、细菌、真菌和线虫的严重限制[3]。其中,由腐皮镰刀菌(Fusarium solani)和尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)为主要病原菌引起的生姜枯萎病是一种毁灭性土传病害,在生姜的不同生长阶段均可感染植株,其防控十分困难[4]。主要是因为病原菌在生姜生长幼苗期、旺盛期、成熟期均可感染植株根茎部并进入组织内部,导致生姜植株发病,引起植株枯萎黄化,甚至全株坏死[5]。目前,应用化学杀菌剂是防治生姜、黄瓜(Cucumis sativus)、棉花(Gossypium hirsutum)等作物枯萎病的主要方法[6-7],然而随着食品安全理念的深化与推进,人们对高品质生活与健康食品的要求不断提高,安全、环保、高效的植物源生物农药的开发研制已成为植物病害防治研究的热点。

植物源生物农药可以作为解决生姜枯萎病的一种有效方案,因它们对非目标生物的毒性非常低,作用特异性更好,可生物降解和环境友好[8-9]。据报道,植物精油对病原真菌具有多种作用,如破坏细胞质膜与质子驱动力,使细胞内物质发生泄漏、细胞内部酸化、阻碍细胞能量的产生和结构成分的合成等,植物精油也可通过阻断麦角固醇生物合成途径抑制细胞生长繁殖[10-11]。姜精油(ginger essential oil,GEO)具有抗真菌活性与药用价值,在食品和制药工业中常作为添加剂[12]。柠檬醛(3,7-二甲基-2,6-辛二烯醛)是一类单萜化合物,广泛存在于多种植物的叶片和果实中。柠檬醛对曲霉菌(Aspergillus)、青霉菌(Penicillium)、木霉菌(Trichoderma)等均具有较强的抑制作用[13]。31%柠檬醛羟丙基-β-环糊精水剂对水稻稻瘟病菌(Magnaporthe grisea)菌丝生长和孢子萌发均有较好的抑制作用,其半数效应浓度(Ec50)分别为21.37 μg·mL−1和35.63 μg·mL−1[14]。陈雨然等[15]研究表明,柠檬醛、合金欢醛、辛醛等醛类物质是多个地区姜精油中的共有组分。本课题组前期研究表明,20 mg·mL−1姜精油完全抑制了腐皮镰刀菌的生长[16],但姜精油对生姜枯萎病菌尖孢镰刀菌的抑菌作用鲜见报道。

因此,本研究以姜精油及其成分柠檬醛对生姜枯萎病菌尖孢镰刀菌的抑菌作用进行研究,并选择抗病能力较弱的竹根姜(Zingiber officinalecv.zhugen ginger)[17]进行盆栽防控试验,以探究解析姜精油与柠檬醛对生姜枯萎病菌尖孢镰刀菌的菌丝生长、孢子萌发、菌丝形态、菌丝细胞膜完整性的作用机制和防控效果,旨在为生姜枯萎病防控开发新的植物源生物制剂提供理论依据,也为植物真菌病害的防控提供新的参考。

1 材料与方法

1.1 供试材料

试验菌株: 生姜枯萎病菌尖孢镰刀菌菌株(F.oxysporumFOX-1)由重庆文理学院园林与生命科学学院(特色植物研究院)惠赠[6],在PDA 培养基上活化后用于后续试验。

供试培养基: PDA 培养基(马铃薯200 g·L−1、葡萄糖20 g·L−1、琼脂18 g·L−1)、PDB 培养基(马铃薯200 g·L−1、葡萄糖20 g·L−1)。

试验植株: 采用在塑料大棚培养2 个月的竹根姜盆栽植株作为接种材料,选取时确保其大小均一、生长状况良好、未受损伤。

试验试剂: 姜精油(纯度>98%)、柠檬醛(纯度>98%)均购自麦克林试剂(上海)有限公司;碘化丙啶(Propidium Iodide,PI),购自Sigma 试剂(上海)有限公司;丙二醛(malondialdehyde,MDA)试剂盒,购自索莱宝(北京)科技有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 生姜枯萎病菌尖孢镰刀菌孢子悬浮液的配制

生姜枯萎病菌尖孢镰刀菌菌株培养5 d 后,用打孔器在菌落边缘打出菌饼(d=6 mm),将菌饼接种至PDB,在28 ℃、150 r·min−1恒温摇床遮光震荡培养3 d,纱布过滤,制成生姜枯萎病菌尖孢镰刀菌孢子悬浮液[浓度为1×106(spores)·mL−1],以备后续试验使用。

1.2.2 生姜枯萎病菌尖孢镰刀菌菌丝生长测定

参考王江来等[18]的方法,采用菌丝生长速率法、十字交叉法和半数效应浓度法(median effective concentration,EC50)检测姜精油和柠檬醛对生姜枯萎病菌尖孢镰刀菌的抑菌效果。分别吸取适量的姜精油和柠檬醛,用30%乙醇(质量体积分数)溶解,配置成8 g·L−1的姜精油和柠檬醛储备溶液。将配置的储备液分别加入到PDA 培养基中(约50℃),配置成含药PDA 平板,使其质量浓度分别为0.125 g·L−1、0.25 g·L−1、0.5 g·L−1、1 g·L−1、2 g·L−1、4 g·L−1,倒入直径为90 mm 培养皿中,每个培养基的溶液体积为10 mL。以不做任何处理的PDA 平板(0 g·L−1姜精油与柠檬醛)为空白对照,以加入30% (质量体积分数)乙醇的PDA 平板为阴性对照,以添加质量浓度为8 g·L−1百菌清[19]的PDA 平板为阳性药物对照。待平板冷凝后,将生长5 d 的生姜枯萎病菌尖孢镰刀菌菌饼(d=6 mm)反接于含药PDA 平板中央,培养于28 °C恒温培养箱中,每隔24 h,用十字交叉法测量各处理菌落直径,将48 h 内完全无菌丝生长的质量浓度作为最小抑菌量(minimal inhibitory concentration,MIC)[18]。每处理设5 个重复。根据生物统计法对病原菌生长抑制率与精油浓度进行毒力分析,以各处理精油浓度的对数为x轴、菌丝生长抑制率为y轴进行回归分析,求出毒力回归曲线方程、相关系数R2和EC50。

1.2.3 生姜枯萎病尖孢镰刀孢子萌发观察

参考孙迪等[10]的方法,将浓度为1×104(spores)∙mL−1生姜枯萎病菌尖孢镰刀菌孢子悬浮液,分别加入不同浓度(0,1/2 MIC,MIC)的姜精油和柠檬醛,以不做任何处理的生姜枯萎病菌尖孢镰刀菌孢子悬浮液(0 g·L−1姜精油和柠檬醛)为空白对照,以加入30% (质量体积分数)乙醇的生姜枯萎病菌尖孢镰刀菌孢子悬浮液为阴性对照,以添加质量浓度为8 g·L−1百菌清的生姜枯萎病菌尖孢镰刀菌孢子悬浮液为阳性药物对照。于28 ℃黑暗培养6 h,随后血球计数板计数统计孢子数量。12 h 后在荧光显微镜(Fluorescence microscope,Leica DM2500,德国)进行观察,以芽管长于孢子直径一半视为萌发,统计孢子萌发数。每处理设5 次重复,每次重复检查3 个视野,每次至少检查100 个孢子数量。

1.2.4 生姜枯萎病菌尖孢镰刀菌菌丝形态观察

将1×106(spores)∙mL−1生姜枯萎病菌尖孢镰刀菌孢子悬浮液加入50 mL PDB 培养基中,分别添加姜精油和柠檬醛,使其终浓度为0、1/2 MIC、MIC,在28 ℃、150 r·min−1恒温摇床遮光震荡培养3 d,收集菌丝。每处理设5 次重复,参考Yu 等[20]的方法制备样品,样品固定后通过真空冷冻干燥机干燥(Vacuum freeze-dryer,FD-1A-50,中国上海),离子溅射镀膜机(Ion sputtering coating machine,SC7620,英国东苏塞克斯)镀膜120 s,所有样品均在扫描电子显微镜(Scanning electron microscopy,SEM,Ion Sputter JFC-1100,日本东京)下观察并拍照。

1.2.5 生姜枯萎病菌尖孢镰刀菌菌丝细胞膜完整性测定

1) PI 染色观察

菌丝收集方法同1.2.4,将少量菌丝体放入2 mL的离心管中,加入500 μL PI 染色液,在37 ℃的水浴锅中进行10 min 遮光染色,0.1 mol∙L−1PBS (pH 7.2)漂洗3 次,每处理设5 次重复,在荧光显微镜下进行观察并拍照。

2)相对电导率含量测定

参考翁甜等[21]的试验方法测定生姜枯萎病菌尖孢镰刀菌的胞外电导率。菌丝收集方法同1.2.4,称取1 g 湿菌丝于50 mL 离心管中,加入30 mL 去离子水重悬浮菌丝,分别加入姜精油和柠檬醛使其终浓度为0、1/2 MIC、MIC,使用便携式电导率仪(DDB-303A,上海翼点科学仪器有限公司,中国)测定0 h、2 h、4 h、6 h、8 h、10 h、12 h 生姜枯萎病菌尖孢镰刀菌的胞外电导率(L),最后将其煮沸处理10 min 后冷却至室温,再次测定电导率(Lʹ),初始电导率为L0。并用以下公式计算相对电导率。每处理设5 次重复。

3)核酸泄露与孢外蛋白含量测定

参考翁甜等[21]的试验方法测定生姜枯萎病菌尖孢镰刀菌的外泄情况。菌丝处理方法同1.2.5 2),分别于0 h、2 h、4 h、6 h、8 h、10 h、12 h 取上清液于12 000 r·min−1离心10 min 后,用紫外分光光度计(752NPlus,上海美谱达仪器有限公司,中国)测定260 nm 波长下的吸光度,测定菌丝体核酸的泄露情况。每处理设5 次重复。

采用考马斯亮蓝G-250 染色法测定菌丝孢外蛋白含量,每处理设5 个重复。

4) MDA 含量测定

菌丝处理方法同1.2.5 2),分别于处理0 h、3 h、6 h、9 h、12 h 后收集不同处理组和对照组的菌丝体,加入提取液,充分研磨,4 ℃、10 000 r·min−1离心10 min,取上清液,根据MDA 试剂盒提供的方法测定生姜枯萎病菌尖孢镰刀菌菌丝体内MDA 含量。每处理设5 次重复。

5)细胞膜上麦角固醇含量测定

参考王江来等[18]方法,测定姜精油和柠檬醛分别对病菌细胞膜上麦角固醇含量的影响。按1.2.4 方法获得的菌丝体,用无菌水洗涤2 次,并记录菌丝净湿重,每处理设5 次重复。接着在85 ℃条件下加入5 mL 新鲜制备的25% (质量体积分数)乙醇/KOH 混合液皂化菌体4 h。皂化完毕冷却至室温,加入5 mL 正庚烷用于提取固醇,剧烈涡旋15 min,并于室温静置分层1 h。上层混合物用于紫外分光光度计检测。麦角固醇和固醇中间体24(28)脱氢麦角固醇在230 nm 和282 nm 处会生成特征吸收曲线(A230和A282),按以下方程式计算麦角固醇含量:

1.2.6 盆栽防控试验

参考Zhang 等[22]的试验方法,进行生姜枯萎病防控效果试验。选择培养2 个月后长势一致的健康竹根姜幼苗作为接种材料,将幼苗分为4 组: 阴性对照组(不做任何处理)、阳性对照组(只接种病原菌)、阳性药物对照组(8 g∙L−1百菌清)和精油处理组(2 g∙L−1姜精油和0.5 g∙L−1柠檬醛)。将20 mL 的姜精油(2 g∙L−1)和柠檬醛(0.5 g∙L−1)溶液均匀喷雾在盆栽幼苗上,24 h 后用注射器将1 mL 生姜枯萎病菌尖孢镰刀菌孢子悬浮液[1×106(spores)∙mL−1]注射到幼苗根茎中。每组处理15 株,正常养护管理,15 d 后观察并记录统计发病情况。根据潘汝浩等[23]描述的方法,对生姜枯萎病进行分级调查,病情指数和防治效果的计算公式如下:

1.3 数据统计与分析

采用Excel 2003 和SPSS 18.0 软件对数据进行统计分析。采用单因素(One-way ANOVA)和Duncan法进行方差分析和多重比较(α=0.05)。利用Origin 2018 软件作图。图表中数据为平均值±标准差。

2 结果与分析

2.1 姜精油和柠檬醛对生姜枯萎病菌尖孢镰刀菌菌丝生长的影响

试验结果(图1、表1)表明,姜精油和柠檬醛对生姜枯萎病菌尖孢镰刀菌菌丝体的生长均有着显著的抑制作用(P<0.05)。处理培养2 d 的生姜枯萎病菌尖孢镰刀菌,姜精油和柠檬醛的MIC 值分别为2 g·L−1、0.5 g·L−1。用0.125～1.0 g·L−1浓度的姜精油处理5 d 后的菌落直径与对照组(CK 与30%E)差异不明显,菌丝抑菌率为7.1%～32.1%,当处理浓度提高到2.0～4.0 g·L−1时,抑菌率达到82.0%～100.0%,差异达显著水平;用0.125～0.25 g·L−1浓度的柠檬醛处理5 d 后的菌落直径明显小于对照组(CK 与30%E),差异水平显著,尤其是0.25 g·L−1及以上浓度与对照相比差异更显著,菌丝抑菌率分别为93.2%、100.0%。同时,研究发现8 g·L−1质量浓度的百菌清,完全抑制了生姜枯萎病菌尖孢镰刀菌的生长,与质量浓度为4 g·L−1姜精油和0.5 g·L−1柠檬醛的抑菌效果无显著差异。为了消除乙醇的影响,研究了30% (质量体积分数)乙醇对生姜枯萎病菌尖孢镰刀菌菌落生长的影响。结果表明,30% (质量体积分数)乙醇对菌落生长几乎没有影响。

表1 姜精油和柠檬醛对生姜枯萎病菌尖孢镰刀菌的抑菌效果Table 1 Inhibitory effects of ginger essential oil and citral on Fusarium oxysporum FOX-1

图1 不同培养时间与不同质量浓度姜精油(A)和柠檬醛(B)对生姜枯萎病菌尖孢镰刀菌菌丝生长的影响Fig.1 Effects of different concentrations of ginger essential oil (A) and citral (B) on mycelial growth of Fusarium oxysporum FOX-1 in different incubation times

2.2 姜精油和柠檬醛对生姜枯萎病菌尖孢镰刀菌孢子萌发的影响

由表2 可知,在姜精油和柠檬醛处理下,处理组的孢子数量、孢子萌发率均与对照组之间存在显著差异(P<0.05)。处理6 h 后,与空白对照(CK)相比,1/2MIC 和MIC 姜精油处理使生姜枯萎病菌尖孢镰刀菌孢子数量分别降低35.6%和59.3%;1/2 MIC 和MIC 柠檬醛处理分别降低61.0%和78.0%;处理12 h 后,1/2 MIC 和MIC 姜精油处理的生姜枯萎病菌尖孢镰刀菌孢子萌发率分别降低20.4%和34.7%;1/2 MIC 和MIC 柠檬醛处理分别降低86.1%和95.0%。试验结果表明姜精油和柠檬醛处理可以显著抑制生姜枯萎病菌尖孢镰刀菌孢子的生长发育。

表2 不同质量浓度姜精油和柠檬醛对生姜枯萎病菌尖孢镰刀菌孢子萌发的影响Table 2 Effect of different concentrations of ginger essential oil and citral on spore germination of Fusarium oxysporum FOX-1

2.3 姜精油和柠檬醛对生姜枯萎病菌尖孢镰刀菌菌丝形态的影响

由图2 可知,姜精油和柠檬醛处理3 d 后,生姜枯萎病菌尖孢镰刀菌菌丝体形态发生了显著的变化。空白对照组的菌丝形态结构完好、表面平坦(图2A),1/2 MIC 和MIC 姜精油以及1/2 MIC 柠檬醛处理3 d后,菌丝表面出现了明显的褶皱和凹陷(图2B,2C,2D),MIC 柠檬醛处理后,菌丝和孢子的表面不仅凹陷程度更加严重,并伴随着异常的断裂(图2E)。

图2 不同质量浓度姜精油和柠檬醛对生姜枯萎病菌尖孢镰刀菌菌丝形态的影响Fig.2 Effects of different concentrations of ginger essential oil and citral on mycelial morphology of Fusarium oxysporum FOX-1

2.4 姜精油和柠檬醛对生姜枯萎病菌尖孢镰刀菌细胞膜完整性的影响

2.4.1 PI 染色观察结果

由图3 可知,经过染色后,空白对照组(图3A)的生姜枯萎病菌尖孢镰刀菌菌丝未发散出可供观测的荧光,而1/2 MIC 姜精油、1/2 MIC 柠檬醛处理3 d后(图3B、C)生姜枯萎病菌尖孢镰刀菌有少数菌丝发出零星的红色荧光;当精油的有效浓度增加为MIC,姜精油和柠檬醛处理3 d 后(图3D、E)的菌丝均能够发散出连续的明亮红色荧光,表明生姜枯萎病菌尖孢镰刀菌的菌丝体细胞膜完整性被破坏。PI染色图片直观反映出姜精油和柠檬醛处理会破坏尖孢镰刀菌菌丝细胞膜,从而增加细胞膜的通透性,致使胞浆外流,菌体内环境稳态失衡,最终导致菌体死亡。

图3 荧光显微镜观察不同质量浓度姜精油和柠檬醛处理的生姜枯萎病菌尖孢镰刀菌表型Fig.3 Phenotype of Fusarium oxysporum FOX-1 observed by fluorescence microscopy subjected to different concentrations of ginger essential oil and citral

2.4.2 相对电导率、蛋白质、核酸含量变化

由图4A-B 可知,经姜精油和柠檬醛处理后,生姜枯萎病菌尖孢镰刀菌菌液的相对电导率与空白对照组(CK)相比均存在显著差异(P<0.05),且随着时间的延续而升高。姜精油、柠檬醛处理2 h 后相对电导率均显著高于CK,当处理12 h 时1/2 MIC 和MIC 姜精油处理的相对电导率分别是CK 的2.4 倍和2.7 倍(图4A),1/2 MIC 和MIC 柠檬醛处理组的相对电导率分别是CK 的2.5 倍和3.2 倍(图4B)。由图4C-F 可知,姜精油和柠檬醛处理后生姜枯萎病菌尖孢镰刀菌菌液的蛋白质与核酸含量随处理时间的延长逐渐升高,表现出与电导率相似的变化趋势,即具有浓度依赖效应,且各处理与对照之间均存在显著差异(P<0.05)。与CK 相比,1/2 MIC 与MIC 姜精油处理的蛋白质含量分别是CK 的1.2 倍和1.6 倍(图4C),1/2 MIC 与MIC 柠檬醛处理的蛋白质含量分别是CK 的1.5 倍和1.7 倍(图4D)。处理12 h 后,1/2 MIC 与MIC 的姜精油处理核酸含量分别是CK 的3.0 倍 和5.0 倍(图4E),1/2 MIC 与MIC 柠檬醛 处理的核酸含量分别是CK 的3.4 倍和4.2 倍(图4F)。试验结果表明,随着姜精油和柠檬醛处理浓度的增加,其对生姜枯萎病菌尖孢镰刀菌菌丝体细胞膜的损伤也逐渐加重。

图4 不同质量浓度姜精油和柠檬醛处理后生姜枯萎病菌尖孢镰刀菌细胞完整性的变化Fig.4 Changes in cellular integrity of Fusarium oxysporum FOX-1 subjected to different concentrations of ginger essential oil and citral

2.4.3 MDA 与麦角固醇含量变化

由图5 可知,当处理时间为12 h 时,1/2 MIC 和MIC 姜精油处理的MDA 含量分别是空白对照组(CK)的1.7 倍和1.8 倍(图5A),1/2 MIC 和MIC 柠檬醛处理组MDA 含量分别是CK 的2.5 倍和3.2 倍(图5B)。姜精油和柠檬醛处理3 d 后生姜枯萎病菌尖孢镰刀菌菌液麦角固醇含量与CK 相比均存在显著差异(P<0.05)。1/2 MIC 和MIC 生姜油处理3 d 后,与CK 相比生姜枯萎病菌尖孢镰刀菌菌液的麦角固醇含量分别降低9.5%和27.0% (图5C);1/2 MIC 和MIC 柠檬醛处理使麦角固醇含量分别降低17.7%和45.2% (图5D)。试验结果表明,姜精油和柠檬醛处理能够使MDA 含量升高,并抑制菌体麦角固醇的合成。因此,本研究推断姜精油和柠檬醛诱导菌丝内物质代谢异常,从而阻碍菌丝的生长。

图5 不同质量浓度姜精油和柠檬醛处理对生姜枯萎病菌尖孢镰刀菌丙二醛(MDA)与麦角固醇(处理3 d)含量的影响Fig.5 Effects of different concentrations of ginger essential oil and citral on malondialdehyde (MDA) and ergosterol contents (treatment 3 days) of Fusarium oxysporum FOX-1

2.5 姜精油和柠檬醛对生姜枯萎病菌尖孢镰刀菌的盆栽防控

由表3 可知,姜精油和柠檬醛处理均可降低生姜枯萎病的发病率。施用姜精油2 g·L−1、柠檬醛0.5 g·L−1处理15 d 后,防控效果分别为32.7%和42.3%,与阳性对照相比防治效果显著(P<0.05)。其原因可能是姜精油、柠檬醛在植株表面形成防御膜而阻止病原菌的菌丝生长和孢子萌发,从而降低发病率,提高防控效果。

表3 姜精油和柠檬醛处理15 d 对生姜枯萎病的盆栽防治效果Table 3 Control effects of 15 days after ginger essential oil and citral treatments on ginger Fusarium wilt

3 讨论与结论

目前我国对生姜枯萎病的防治以化学防治为主,但化学杀菌剂的广泛使用不但使生姜产生抗药性,还会导致严重的环境污染和食品安全等问题。植物精油已成为当前最受欢迎的一类植物源杀菌剂,是植物病害生物防治领域研究的热点[24]。植物精油的抗真菌活性依赖于其生物活性成分,柠檬醛在姜精油中占比达19.5%,广泛应用于香精、香料的制造和美容行业[15],但在农业病害防控领域的应用研究较少。因此,开展姜精油及其成分柠檬醛对生姜枯萎病菌尖孢镰刀菌的作用机理与防治效果研究,对拓展利用植物源活性物质杀菌具有指导参考价值。

为了研究姜精油和柠檬醛对生姜枯萎病菌尖孢镰刀菌的抑制作用是否依赖于其直接的抗真菌活性,本研究首先评估了不同质量浓度姜精油和柠檬醛对生姜枯萎病菌尖孢镰刀菌菌丝生长的影响。结果显示,姜精油和柠檬醛显著抑制了生姜枯萎病菌尖孢镰刀菌菌丝的生长(图1,表1)。宿主植物的二次感染多由分生孢子引起。因此,理论上任何可以抑制孢子产生和孢子萌发的杀菌剂,都会有助于减轻病害的发生[25]。故本研究进一步研究了不同质量浓度姜精油和柠檬醛对生姜枯萎病菌尖孢镰刀菌孢子数量和孢子萌发的影响。结果表明,两种植物精油能显著抑制生姜枯萎病菌尖孢镰刀菌的孢子产生和孢子萌发(表2)。这与姜精油和柠檬醛对其他病原菌的抑制作用相似。Xi 等[16]研究发现,20 mg·mL−1姜精油基本抑制了腐皮镰刀菌菌丝的生长与孢子萌发,经10 mg·mL−1姜精油处理后,菌丝失去光滑度,发生扭曲、变形,甚至断裂等形变现象。王刘庆等[26]研究发现,10 μL 柠檬醛熏蒸处理,可以完全抑制互隔交链孢(Alternaria alternata)菌丝的生长,5 μL 柠檬醛熏蒸处理,基本可以抑制其分生孢子的产生,1.25 μL 和2.5 μL 柠檬醛熏蒸可使互隔交链孢菌丝出现断裂现象。本研究扫描电镜观察结果显示,与CK 相比,姜精油和柠檬醛处理后,生姜枯萎病菌尖孢镰刀菌菌丝也发生了褶皱、扭曲、断裂等形变现象(图2)。综上,姜精油和柠檬醛可能通过直接抑制病原菌的营养生长和生殖生长,破坏病原菌细胞结构,从而达到减轻病害发生的目的。

细胞膜是真菌组织结构的一部分,能够维持真菌正常的生理结构,是细胞与外界环境进行物质交换和信息传递的重要通道,能够有效调节细胞内外环境的稳定,保障真菌的正常生命活动[20]。在本研究中,姜精油和柠檬醛处理组的PI 染色荧光强度明显高于对照组。活细胞具有完整的细胞膜,会阻碍PI染色液与细胞内DNA 结合,导致荧光强度较弱。因此,荧光效应的差异也表明姜精油和柠檬醛具有破坏细胞膜结构和改变其通透性的能力,这与姜精油和柠檬醛对单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes)、黑曲霉(Aspergillus niger)的PI 染色结果一致[27-28]。细胞膜的损伤通常会出现细胞内物质泄露现象[29-30]。因此,检测了姜精油和柠檬醛对生姜枯萎病菌尖孢镰刀菌菌丝细胞渗漏的影响,发现经1/2 MIC 和MIC 姜精油与柠檬醛处理的生姜枯萎病菌尖孢镰刀菌细胞内容物有明显的泄漏。具体来说,随着姜精油和柠檬醛处理浓度和处理时间的增加,生姜枯萎病菌尖孢镰刀菌菌丝的相对电导率、核酸和胞外蛋白质含量呈明显的上升趋势。破坏细胞膜是一些植物精油的常见标靶,例如,Gunasena 等[29]研究发现,姜精油通过破坏水稻枯萎病菌(Burkholderia glumae)细胞膜的通透性,导致细胞内容物质泄露,从而减轻水稻枯萎病的发生;张晶晶等[30]研究发现,柠檬醛通过改变曲霉菌菌丝形态、细胞形态、细胞微观结构,破坏了细胞膜完整性与通透性、膜的物理参数以及细胞代谢途径,起到抑制青霉菌(Penicillium italicum)和曲霉菌(Aspergillus niger)的作用。

真菌的细胞膜上富含多种脂质,分为甘油类、磷脂类、鞘脂类和固醇类[31]。麦角固醇是酵母和丝状真菌细胞膜的主要固醇成分,负责维持正常生长、活力、细胞完整性和功能,因此它是抗真菌药物的作用靶点[32]。麦角固醇水平的降低会导致真菌细胞膜破裂,产生不可逆转的细胞损伤[33]。Kumar 等[34]研究发现,多种精油通过降低麦角固醇生物合成,破坏对小麦链格孢杆菌(Alternaria alternata)的细胞膜,从而延长小麦籽粒保质期。Ferreira 等[35]发现姜精油浓度高于1000 μg·mL−1时,禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)细胞膜上麦角固醇含量明显降低;Wei等[36]研究发现0.4 μL·mL−1柠檬醛处理使细胞膜上麦角固醇含量下降66.7%。MDA 含量是细胞膜脂过氧化的指标,它反映了膜脂过氧化和细胞膜损伤程度[31]。本研究发现,与CK 相比,MIC 浓度的姜精油(2 g·L−1)和柠檬醛(0.5 g·L−1)使麦角固醇含量分别降低27.0%和45.2% (图5C、5D),可以推断姜精油和柠檬醛与生姜枯萎病菌尖孢镰刀菌的细胞膜相互作用,导致麦角固醇的生物合成受到阻碍。此外,姜精油和柠檬醛处理增加了生姜枯萎病菌尖孢镰刀菌中MDA 的含量,说明尖孢镰刀菌发生了脂质过氧化,加重了对细胞膜的损伤,抑制了菌丝的生长。

本研究在验证姜精油和柠檬醛抑菌机理的同时,还测试了姜精油和柠檬醛降低生姜枯萎病菌尖孢镰刀菌致病力的能力。据报道,多种植物精油可以诱导植物的防御反应,缓解病害的发生[37-38]。包华等[37]研究发现胡椒碱可通过抑制番茄灰霉病菌(Botrytis cinerea)菌丝细胞中的防御酶活性从而抑制菌丝生长;Wang 等[38]研究发现,花椒(Zanthoxylum bungeanum)籽粒提取物熏蒸剂有效抑制了烟草黑胫病菌(Phytophthora nicotianae)菌丝生长,显著降低烟草黑胫病的发病率。本研究发现姜精油和柠檬醛通过抑制生姜枯萎病菌尖孢镰刀菌菌丝的生长发育,降低生姜枯萎病菌尖孢镰刀菌的致病力,从而降低生姜枯萎病的发病率(表3)。但是,在研究姜精油和柠檬醛对生姜枯萎病抑菌活性的基础上,要进一步提高其对生姜枯萎病菌的防治效果,还应通过分子层面上探索其对生姜枯萎病菌的作用机理,了解其作用靶点,为田间防治提供科学依据。

本研究以生姜枯萎病菌尖孢镰刀菌为靶标,测试解析了姜精油与柠檬醛对其菌丝生长、孢子萌发、菌丝形态、菌丝细胞膜完整性的作用机制,并证实其盆栽试验防控效果较好,为生姜枯萎病菌的防治提供了新的思考,为新型无公害生物防治药剂的研制提供了参考借鉴。