氧化应激在非酒精性脂肪性肝病发生发展中的作用*

苏会吉 颜耿杰 陈含笑 班少群 黄小桃 韦艾凌, 毛德文 龙富立△

1.广西中医药大学研究生院 (广西 南宁, 530200) 2.广西中医药大学第一附属医院肝病二区

非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)是一种受环境、代谢、基因、免疫和肠道微生态等多种因素和机制调控的复杂疾病,由于脂肪堆积过多导致肝实质细胞脂肪变性,包括从单纯性脂肪变性发展为脂肪性肝炎(NASH)、肝纤维化,甚至转变为肝功能衰竭和肝细胞癌(HCC)的临床病理综合征[1]。NAFLD与代谢综合征、2型糖尿病、肥胖和高血压、心脏和肾脏疾病相关,其有害影响正成为公共卫生面临的日益严峻的挑战。脂肪变性是NAFLD的先决条件,虽是良性表现,但20%～30%的患者会出现肝脏炎症,而炎症、肝细胞肿胀和不同程度的纤维化是NASH的病理特征,肝纤维化的严重程度可使NASH向HCC进展[2]。因此,控制NAFLD-NASH-HCC的发生发展具有重要的临床意义。

NAFLD发病机制经典的“二次打击”理论中,各种原因引起的肝细胞胞质内脂质过多蓄积引起胰岛素抵抗是第一次打击,降低了肝脏的抗打击能力。第二次打击是由于活性氧(ROS)、脂多糖(LPS)、免疫系统分泌的一些细胞因子和脂肪组织增加,而引发一系列细胞毒性事件,导致肝脏炎症过度反应[3]。由活性氧(ROS)介导的氧化应激(OS)可能在“二次打击”中发挥重要作用,OS引起膜磷脂的过氧化并改变膜的渗透性,促进炎症因子的释放,刺激Kupper细胞(KOs)、肝星状细胞和肝细胞诱导NAFLD进展,导致NASH坏死性炎症和纤维化发展[4]。ROS和炎症诱导的OS是导致肝细胞死亡、组织损伤的主要因素。

1 ROS及OS

ROS广泛存在自然界中,是机体生理代谢的副产物,当受到外界环境刺激时也会产生,通常带有氧原子或氧化基团,使得ROS具有强氧化性。常见的ROS有过氧化氢(H2O2)、超氧阴离子自由基(O2-)。在细胞呼吸过程中,线粒体将电子转移到氧气中并产生ROS,若缺氧和有毒物质累积可导致线粒体内膜电子传递链(ETC)的氧化磷酸化线粒体ROS(mtROS)产生过多,ROS迅速释放到细胞质中导致细胞损伤[5]。线粒体Ca2+参与能量产生,Ca2+过载对线粒体功能损害,影响mtROS生成。过氧化物酶体中的ROS、活性氮(RNS)是由于D-氨基酸氧化酶和过氧化物酶体β氧化产生H2O2所致。内质网(ER)是ROS的细胞内来源,ER氧化还原素1α和蛋白质二硫化物异构酶的破坏诱导蛋白质的错误折叠,产生ROS[6]。此外,细胞质基质和质膜中的NADPH氧化酶(NOX)、黄嘌呤氧化酶、细胞色素P450(CYP)2E1、环加氧酶和脂氧合酶等酶也可产生ROS,尤其是H2O2。适量的ROS有助于正常的细胞生长、衰老的凋亡,但ROS含量超过一定限度就会打破正常生理平衡。脂质代谢紊乱导致肝细胞中的脂肪堆积,从而触发细胞器如线粒体、ER和NOX产生ROS。线粒体和微粒体中脂肪酸的β氧化增加在NAFLD中可产生更多的ROS。线粒体通过氧化磷酸化产生ATP,同时产生超氧化物歧化酶(SOD)。

OS是机体抗氧化剂系统无法清除ROS过量产生的毒性作用而导致DNA和组织损伤的过程。由内外源条件下引起OS时,过量的ROS会触发病理性氧化还原信号传导,导致细胞内蛋白质、脂质的DNA受到损伤,甚至导致细胞衰老死亡。当脂毒性代谢物积聚在细胞内时,它们可以通过解耦氧化磷酸化,诱导ROS产生介导OS,从而导致线粒体功能障碍,发生一系列肝脏细胞损害事件。在NASH发展过程中,肝脏OS的发生可能与不饱和脂肪酸的脂质过氧化形成的高反应性醛产物和4-羟基-2-壬烯醛有关,还可能是由于肠道微生物群相关的炎症和内质网应激所致[7]。OS诱导许多氧化还原敏感转录因子和促炎递质的激活,如核因子kappa B(NF-κB)、早期生长反应-1和激活蛋白1、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素(IL)等,可导致肝脏炎症,纤维化和细胞死亡。

2 OS促进NAFLD发生发展的机制

2.1 OS与肝脂肪变性 肝细胞中ROS的产生由线粒体ETC驱动,线粒体是重要的代谢和信号枢纽,负责生产超氧阴离子,并通过β-氧化、三羧酸循环、电子运输和ATP合成等途径维持肝细胞平衡[8]。ROS介导的OS直接干扰线粒体功能,影响肝细胞中的脂肪酸氧化、脂质合成和蛋白质合成。NAFLD患者中,β-游离脂肪酸摄入过多和ETC活性增加,导致ROS的释放增加,大量ROS直接靶向线粒体,导致能量代谢减少、线粒体DNA过表达和线粒体功能障碍,引发胰岛素抵抗、脂质代谢紊乱、炎症和肝细胞凋亡[9]。受损的线粒体无法代偿脂肪酸的氧化代谢,mtROS使得膜电位紊乱,降低线粒体自噬的保护机制,促进细胞质中脂肪的合成。而胰岛素抵抗也会促进OS诱导脂肪变性。单纯性肝脂肪变性可通过CYP2E1诱导引起细胞内ROS上调,增加ROS反过来又引起OS。

AMP活化蛋白激酶(AMPK)参与多种细胞代谢途径的调节。高水平的ROS可激活AMPK参与代谢,AMPK通过抑制乙酰辅酶A羧化酶和转录因子[PPARα、PPARγ、甾醇调节元件结合蛋白(SREBPs)]等脂质相关代谢酶的活性,减轻脂质积累并促进脂肪酸氧化[10]。SREBP1c的上调与H2O2触发的OS有直接关系,SREBP1c的过表达提高肝细胞中的ROS水平,增加脂质合成,并激活NF-kB炎症通路,促进肝脂肪变性[11]。细胞中的抗氧化酶如超氧化物歧化酶(SOD2)、过氧化氢酶(CAT)和谷胱甘肽过氧化物酶(GPxs)参与脂肪酸代谢,SOD2是调节线粒体基质中ROS代谢的关键成分,ROS被SOD2中和,转化为活性较低的H2O2,而后CAT和GPx酶将其还原为水[12]。核因子红细胞2相关因子2(NRF2)是一种抗氧化转录因子,可负调节ROS介导的OS。NRF2在细胞核中的表达增加会诱导抗氧化基因的表达,并抑制游离脂肪酸诱导的ROS产生。激活的NRF2抑制白色脂肪组织的脂质积累,减少脂肪生成,进而诱发胰岛素抵抗和葡萄糖不耐受,导致ob/ob小鼠的肝脏脂肪变性[13]。

2.2 OS与肝脏炎症 脂肪变性后,肝细胞内的脂质持续堆积刺激巨噬细胞释放炎症因子,引起肝脏的严重炎症反应,导致NASH。肝巨噬细胞包括单核细胞衍生的巨噬细胞以及驻留的KCs。mtDNA从肝细胞中释放出来并被巨噬细胞识别,释放TNF-α、JNK、NF-κB及IL-6在内的过量炎症因子,并刺激cGAS-STING通路表达[14]。STING通路由mtDNA激活,并在肝脏和其他组织中发挥作用。NASH小鼠模型中,即使存在mtDNA诱导的KCs刺激,缺乏STING也会减轻肝脂肪变性、纤维化和核因子NF-κB依赖性炎症[15]。mtDNA的释放构成损伤相关分子模式,是对肝细胞中ROS介导的OS引起的线粒体功能障碍的反应。有研究发现释放到细胞质中的mtDNA和氧化的mtDNA能够进一步引起核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3(NLRP3)炎性小体的激活[16]。

当存在LPS或其他刺激时,KCs和其他巨噬细胞通过吞噬细胞氧化酶gp91phox或NOX2系统迅速释放ROS,NOX2被激活后产生超氧化物,向硫氧还蛋白、蛋白激酶C、细胞外信号调节激酶家族成员和NF-κB发送信号,加剧促炎症因子的产生[17]。线粒体内膜蛋白可增加质子转移以下调线粒体膜电位以减轻ROS介导OS的损伤。在NAFLD中,脂肪的积累导致肝脏中内毒素/LPS水平的增加,诱导KCs的M1极化,线粒体内膜蛋白被定向破坏,导致ROS过度产生,并激活MAPK和NF-κB通路介导炎症促炎性细胞因子分泌[18]。KCs分泌的促炎细胞因子诱导中性粒细胞的浸润和造血干细胞的激活,加剧了肝脏损伤,导致肝纤维化的进展。此外,炎症应激和脂质堆积在促炎症IL、TGF-β等递质的帮助下,促进NAFLD进展。

2.3 OS与肝纤维化 肝纤维化是过量的细胞外基质蛋白的积累,随着时间的推移会导致瘢痕组织沉积并扭曲肝脏的结构,其特征在于肝星状细胞(HSC)的活化[19]。持续的肝细胞损伤和炎症反应导致HSCs的激活。ROS诱导的肝细胞凋亡诱导损伤相关分子模式的释放,激活KCs并招募免疫细胞,从而增加细胞因子和趋化因子的产生,导致HSC活化,并刺激胶原蛋白Ⅰ产生[20]。胶原蛋白Ⅰ是TGF-β驱动的纤维化的重要细胞内信号传导递质,TGF-β是诱导造血干细胞活化的重要细胞因子。TGF-β参与伤口愈合和血管生成,过量的TGF-β从受损的肝细胞和促炎性KCs释放,被造血干细胞上的TGF-βRI受体识别,并通过SMAD2/3信号途径增加纤维化[21],此时磷酸化的SMAD2/3可激活NOX4表达。

NOX酶复合物和线粒体是内源性ROS的主要生产者。NOX4减少可降低造血干细胞的活化,但不影响TGF-β1受体表达和SMAD2磷酸化,表明ROS由NOX4介导的TGF-β1和SMAD复合物的下游[22]。HSC活化的下调主要取决于NOX4的缺乏。除了NOX4,NOX1和NOX2也在造血干细胞中表达,NOX1或NOX2消耗可减少由四氯化碳和胆管结扎引起的炎症和纤维化[23]。NOX4无需诱导细胞质亚基形成活性酶来产生ROS,说明NOX4比NOX1和NOX2更快地产生ROS。NLRP3炎症小体在HSCs中表达,并有助于HSCs的活化。一项研究发现,NLRP3的清除下调了HSCs中ROS的产生以及纤维化标志物的mRNA和蛋白质水平[24]。ROS诱导OS在TGF-β介导的造血干细胞纤维化中起重要作用。

2.4 OS与TCC 在胆碱缺乏高脂肪饮食诱导的NASH小鼠模型中,CD8+T和自然杀伤T细胞的激活加速肝脏肿瘤发生[25]。ROS可导致基因组中的点突变或损伤,抗氧化系统通过保护健康细胞有效预防癌变。OS在癌症中的作用仍有争议,ROS是肿瘤微环境的一部分,抗氧化系统可能同时发挥抗癌和促癌作用。研究显示,硫氧还蛋白还原酶-1、谷胱甘肽还原酶和NRF2等氧化应激相关酶和受体作为HCC发生的主要参与者[26]。通过磷酸戊糖途径增加NADPH氧化酶是抗癌细胞的一种新兴的耐药机制,间接证实OS的抗癌作用是肿瘤细胞对抗氧化损伤的适应性[27]。

NOX家族包括膜结合的酶复合物,代表细胞质中的ROS生成者,NOXs通过从NADPH转移电子穿过生物膜直接催化O2的产生,调节氧化还原敏感的信号传导途径[28]。NOXs产生ROS增加OS,而ROS是肝损伤的主要特征,持续性肝损伤与HCC预后不良及侵袭性有关。NOX衍生的ROS通过调控蛋白激酶C、JAK-STAT、MAPK和AKT通路参与肿瘤转化的信号通路。一项研究表明,由NOX1介导的巨噬细胞中产生的ROS通过STAT3和ERK信号通路维持携带致癌基因的突变肝细胞的生存和生长,从而促进HCC的发展[29]。ROS介导的NOX2增加,HCC细胞可诱导巨噬细胞极化为M2耐受表型,促使癌症增殖[30]。在HFD诱导的HCC发生过程中,NOX亚基p22phox在肿瘤前肝病灶中表达,盐皮质激素螺内酯与β-糖基异槲皮苷联合使用能够通过降低p67phox表达和p22phox阳性的数量来预防这些脂肪变性诱导的癌前病变细胞[31]。

3 基于氧化应激的中医药干预治疗

3.1 中药单体及其成分 陈刘欣等[32]发现蛹虫草多糖(CMPS)喂饲高脂饮食诱导模型组可增加肝脏抗氧化酶SOD活性,降低LPO含量,减轻肝脏脂肪变性,并且CMPS组肝脏中PPARα及ACOX1的mRNA和蛋白表达均上调,表明CMPS有明显的抗氧化功效,对NAFLD具有保护作用。郭洁等[33]发现广藿香酮能降低高脂膳食诱导的NAFLD大鼠肝组织脂肪含量,降低血清中TG、LDL和TC水平,升高HDL水平,并显著性升高SOD、GSH-Px活性,降低MDA水平。NAFLD小鼠模型中,表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)喂养小鼠的肝组织中SOD、GSH-Px、CAT活性升高了54.82%,MDA含量降低了86.06%,差异有统计学意义[34],说明EGCG对提示增强内源性抗氧化系统功能具有重要意义。

3.2 中成药 习晓丽等[35]选取60例NAFLD患者设置不同药物治疗组,观察绞股蓝总苷胶囊对氧化应激指标的影响,结果显示SOD、GSH-Px、T-AOC水平升高,而MDA降低,表明其可保护肝细胞,改善NAFLD糖脂代谢紊乱,抑制氧化应激反应。在动物实验中,OS损伤的NAFLD小鼠当使用飞利肝宁胶囊干预后,发现肝脏SOD活性增强、MDA含量有所降低,从而维持机体氧化和抗氧化系统的平衡,延缓NAFLD进展[36]。

3.3 中药复方 实验研究发现用调肝祛脂汤治疗后,CGI-58水平显著增加,而NLRP3炎性小体蛋白,IL-1β和TNF-α水平显著下降,表明调肝祛脂汤通过调节CGI-58和NLRP3炎症小体对NAFLD诱导的大鼠发挥了一定的保护作用[37]。张悦等[38]观察理中汤干预NASH小鼠研究发现,理中汤可通过上调肝组织中Keap1、Nrf2、HO-1的基因表达,改善Keap1/Nrf2/ARE信号通路相关蛋白表达,抑制炎症因子的释放,进而改善NASH大鼠肝功能、血脂,达到抗氧化应激的疗效,阻断NASH进展。彪雅宁等[39]使用当归芍药散治疗NAFLD时,发现Keap1/Nrf2信号通路表达升高,血清和肝脏中SOD和GSH活性明显升高,MDA含量明显降低,活化肝脂肪变性减轻,说明当归芍药散防治NAFLD的机制与提高抗氧化能力相关。

4 总结与展望

NAFLD不再被认为是单纯的肝脂肪性变,而是可进展为NASH、失代偿期肝硬化甚至HCC的动态疾病,如何控制其发生、降低其危害,是我们亟需认真研究解决的重大课题。目前尚无特异性及有效的治疗方法,发现预防或延缓NAFLD进展的方法已成为全球关注的焦点。氧化应激在肝脂肪变性发展阶段扮演着至关重要的角色,开发新颖的治疗靶点,有助于有针对性的个体化治疗。中医药通过调控氧化应激途径、调节能量平衡、抑制参与脂肪生成的关键酶,在减轻肝脂肪变性、改善纤维化方面已取得很好的临床疗效。中医强调因人制宜、辨证论治,中药单体及复方通过多途径、多靶点发挥作用,虽成效有佳,但关于疗效与个体之间的差异的关系尚未明了,还需深入探讨各药物在细胞内外作用的代谢过程。