诱导多能干细胞在儿童遗传性疾病治疗中的应用进展

谢欣 综述，尹晓娟 审校

1.南方医科大学第二临床医学院，广东 广州 510515；2.中国人民解放军总医院儿科医学部，北京 100700；3.中国人民解放军总医院海南医院儿科，海南 三亚 572000

体细胞可经转录因子的共同表达恢复多能状态，由此产生的细胞称为诱导多能干细胞（induced pluripotent stem cells，iPSCs）［1］。iPSCs 能从3 个胚层（内胚层、外胚层和中胚层）分化为所有类型的细胞［2］，在各系统疾病中具有广阔的应用前景。任何一种活体细胞均可重编程为iPSCs，但至今尚无用于制造iPSCs 的首选体细胞。既往自体干细胞均是通过有创性方法获得，如骨髓穿刺、抽脂术或侵入性血液采集［3］；目前，还可通过皮肤穿刺活检、头发、尿液及外周血样本等微创技术获取自体细胞［4］。由于胚胎干细胞（embryonic stem cells，ESCs）是从异体未植入的胚泡中分离获得，存在不可避免的伦理问题，且这种异体来源的细胞在进行细胞替代治疗时，移植入患者体内可能引起免疫排斥反应［5］。iPSCs 源于患者自体细胞，避免了伦理问题及免疫排斥带来的影响。因此，iPSCs 在医疗应用上比ESCs 更具优势。本文就基因重编程技术、iPSCs 的疾病模型及其在儿童遗传性疾病中的应用进展作一综述，以期为iPSCs 在各种遗传性疾病机制及治疗方法研究中的应用提供参考。

1 基因重编程

1.1 基因重编程的分类 重编程方法分为整合和非整合两种。整合重编程方法是通过整合病毒载体，利用逆转录病毒和慢病毒等病毒转导，在体细胞中过表达OCT3／4、SOX2、c-Myc和KLF4，从而使体细胞转化为iPSCs［6］。整合方法由于基因组整合可导致体细胞染色体发生插入突变及病毒残留［7］，且使用原癌基因c-Myc进行基因再激活可能增加转基因源性肿瘤形成的风险［6］。非整合重编程方法中的非整合载体包括游离质粒、腺病毒、仙台病毒（Sendai virus，SeV）、PiggyBac 转座子、微环、mRNA 及蛋白质等［8］。SeV 载体是一种单链RNA 病毒，是目前最常用非整合逆转录病毒［9］，现已成功用于新生儿和成人成纤维细胞及血细胞的高效重编程［10］。SeV 重编程不仅效率及可靠程度高，能对许多体细胞类型重编程，且在较高代次的大多数iPSCs中完全无病毒残留［8］。但SeV的RNA清除缓慢，需持续筛选至第10代才可能清除SeV 的转录痕迹［11］。因此，研究高效、安全的重编程方法是目前亟需解决的问题。OKUMURA等［12］报道了一种新的SeV 载体SeVdp-302L，该载体携带了4个KOSM 转录因子（KLF4、OCT4、SOX2和c-Myc），能激活干细胞中富集微小核糖核酸-302（micro ribonucleic acid，microRNA-302），可自清除小干扰RNA（small interfering ribonucleic acid，siRNA），提高重编程效率。携带4种转录因子的SeVdp载体（SeVdp-302L）可通过siRNA 靶向病毒RdRp从iPSCs中移除，而microRNA-302 的靶序列位于L基因的3 '端的非编码区，可特异性抑制iPSCs中慢病毒载体介导的转基因表达，有效促进无转基因iPSCs生成［13］。SeVdp-302L 介导的重编程方法无需额外重编程增强子，可简单高效地生成无转基因hiPSCs［12］。这种新SeV载体在未来可能成为生产用于临床应用hiPSCs的重要工具。

1.2 基因重编程效率的提高 基因重编程不完全或效率低下可能导致iPSCs恢复原来的成熟体细胞特征，且部分重编程可使细胞失去多向分化潜能，影响其临床应用，且这些部分重编程细胞具有较高的致瘤倾向［14］。目前已有多种方法用于提高重编程效率，如组蛋白去乙酰化酶抑制剂——丙戊酸可在不引入转录因子c-Myc的情况下有效诱导iPSCs，并使重编程效率提高超过100 倍［15］。另外，有研究将髓细胞组织增生原癌基因（myelocytomatosis oncogene，MYC）蛋白的高效反式激活结构域与转录因子OCT4的氨基端结合，结果表明，可显著提高诱导重编程效率［16］。在重编程过程中，OCT4是重要转录因子，该因子的表达水平决定了体细胞的发展方向（体细胞多能状态的恢复水平）［17］。研究发现，将OCT4的相对表达量提高至3 倍，同时保持其他3 个转录因子（SOX2、KLF4和c-Myc）的适度表达水平，可提高重编程效率［17］。另外，OCT4和KLF4的高表达水平结合SOX2和c-Myc的中或低表达水平可提高重编程效率［18］。研究发现，维甲酸诱导基因1蛋白样受体通路［retinoic acid inducible gene 1 protein（RIG1）-like receptor pathway，RLR］介导的先天免疫信号也参与重编程过程并发挥重要作用［19］，敲低RLR 中间蛋白干扰素β启动子刺激因子1（adaptor protein interferon-beta promoter stimulator 1，IPS-1）可减弱下游多能因子的表达，使iPSCs生成减少，而在维甲酸诱导基因1 受体样受体［retinoic acidinducible gene 1（RIG-1）receptor-like receptor，RLR］激动剂参与下，iPSCs 菌落产量增加［19］。HERNANDEZ 等［20］研究发现，从ESCs中分离出缺乏酶结构域的发育多能性相关小蛋白（develop-mental pluripotency associated 2／4，Dppa2／4），作为染色质相关的ESCs 特异性因子可调节体细胞向多能性的过渡。当Dppa2／4与染色质结合时，能通过DNA 损伤反应途径启动所有染色质分解，导致体细胞基因下调及ESCs 增强子激活，该过程可使体细胞向多能性过渡［20］。当Dppa2／4 与OKSM 转录因子（OCT4，KLF4，SOX2和c-Myc）共表达时，重编程效率可超过80%，同时加快重编程进展，在2～4 d内生成iPSCs［20］。

2 iPSCs的疾病模型

人类诱导多能干细胞（human induced pluripotent stem cells，hiPSCs）的疾病模型能表现出与人类疾病相似的病理特点，比源于动物或肿瘤细胞的疾病模型更具有预测性［4］。且利用基因重编程技术获得的患者特异性iPSCs能够保留原突变，为研究相关的发病机制和探索有效治疗方法建立有用的体外模型，如从诊断为遗传性酪氨酸血症Ⅰ型患者体内获取外周血单核细胞，通过重编程技术成功构建出相同疾病表型的iPSCs细胞系，该模型保留了原富马酰乙酰乙酸水解酶（fumarylacetoacetate hydrolase，FAH）基因突变，且拥有与患者相同的基因组［21］。

hiPSCs的疾病模型具有非常可观的应用前景，在多种难治性疾病研究方面已取得了较大进展［22］，如帕金森病、阿尔茨海默病、肌萎缩性侧索硬化症等多种神经退行性疾病，iPSCs已成功建立相关疾病模型，同时结合三维打印技术，可为研究疾病发展机制提供更能准确反映疾病发生发展过程的三维疾病模型［23］。iPSCs疾病模型在高通量疾病表型筛选及药物筛选方面也具有较多优势，如利用hiPSCs大规模分化产生感觉神经元来进行高通量疼痛表型筛选，并通过该模型进行2 700个化合物的化学基因组学筛选，用于分析能抑制藜芦定诱发兴奋性的机制范围［24］。

遗传性疾病是影响儿童健康的重要问题，由于缺乏合适的研究模型，这些疾病的发病机制未明确，导致在这些疾病的治疗方面也面临许多困难。iPSCs的发现在干细胞研究领域具有重要意义，相关研究进展为儿童遗传性疾病的治疗带来了希望。

3 iPSCs在儿童遗传性疾病中的应用

大多数儿童相关罕见疾病均是遗传性疾病，其病因复杂，患者几乎无根治希望。研究遗传性疾病的发病机制是治疗疾病的关键。iPSCs 能分化产生任何类型的细胞，且源自患者，易于获取，因此成为许多基因突变疾病模型的细胞来源。iPSCs 不仅是不同遗传性疾病病理分子研究的重要工具，也是对新分子进行大规模评估的理想工具，为开发新疗法拓展了途径。iPSCs 结合一些先进的基因编辑技术使儿童遗传性疾病的治愈成为可能。

3.1 脊髓性肌萎缩症（spinal muscular atrophy，SMA）SMA 是严重危害新生儿和儿童健康的遗传性疾病，也是导致婴儿死亡的主要原因，约每40 个儿童中有1 个是该突变基因的携带者［25］。SMA 是一种由运动神经元存活基因1（survival motor neuron gene 1，SMN1）突变引起的早发性疾病，为常染色体隐性遗传，SMN1基因突变导致运动神经元（motor neurons，MNs）退化，使患儿逐渐出现肌肉萎缩［26］。SMA 可根据身高表型、开始运动的年龄和达到的最高运动能力分为1A、1B、1C、2A、2B、3A、3B 和4 型［25］。不同类型SMA 患者的iPSCs 疾病模型能表现出不同的SMN 蛋白表达水平［25］。SMA 1型的SMN蛋白水平低于2、3和4型细胞，因此1 型患者通常出生不久发病，病情进展迅速，可在约2岁时死亡［25］。SMA患者的iPSCs还能用来进行药物筛选，研究发现，丙戊酸和妥布霉素可诱导SMA 患者的iPSCs，提高SMN 蛋白水平［26］。HOR等［27］首次通过SMA 脊髓类器官模型发现，可能是由于SMN 蛋白缺失所致，SMA 患者脊髓MNs 中的细胞周期相关基因表达丰富，通过测试周期蛋白依赖性激酶（cyclin-dependent kinases 4／6，CDK4／6）抑制剂在处理SMA 脊髓类器官7 d 后，逆转SMA 患者MNs的变性，可挽救SMA NNs。iPSCs技术在SMA治疗方面的研究也在不断突破，如将iPSCs分化的MNs注入SMA动物模型中，可恢复动物神经肌肉功能，延缓肌肉萎缩［28］。ZHOU 等［29］将iPSCs技术与新的基因编辑系统——先导编辑（prime editing，PE）结合，通过靶向删除SMN2的内含子剪接沉默子序列，抑制SMN2第1号外显子的替代剪接，从而恢复SMN2全长SMN 蛋白基因mRNA的表达，最终成功翻译完整的SMN蛋白，且SMN 蛋白水平与正常对照组iPSCs 相似，明显高于SMA-iPSCs 组。SMN2 表达的SMN 蛋白成功弥补了SMN1突变带来的损失，从而达到疾病治疗的目的。

3.2 色素性视网膜炎（retinitis pigmentosa，RP） RP导致的夜盲症可在儿童期早期发病，并表现为不可逆、遗传性视网膜病变，色素性视网膜炎三磷酸鸟苷酶调节剂（retinitis pigmentosa GTPase regulator，RPGR）基因突变是该疾病最常见的病因［30］。RP是目前全球范围内致盲的主要病因，由于发病机制尚未明确，无法根治［30］。DENG 等［30］获取3名患有RP儿童的尿细胞培养iPSCs，将其分化为视网膜色素上皮细胞并培养为视网膜类器官，建立RP 疾病模型。在该疾病模型中，表现出患者视网膜中视蛋白发生脱位，视网膜外端结构短于正常对照组，且不正常的杆状细胞数量较对照组明显增多［30］，表明在患者的视网膜中RPGR突变可导致杆状细胞和光感受器的形态异常。不断发展的基因编辑技术也为该病的治疗带来了突破。通过基因修正工具——规律成簇间隔短回文重复和CRISPR相关蛋白9（clustered regularly interspersed short palindromic repeats and CRISPR-associated protein 9，CRISPR／Cas9）系统进行基因纠正后，患者来源iPSCs分化视网膜色素上皮细胞的酪氨酸蛋白激酶Mer 表达恢复，且存在光受体外段吞噬功能［31］。与二维细胞培养比较，三维细胞培养能展现出视网膜的结构及空间分布情况，可充分表达RP 的疾病病理特点。近年，随着三维视网膜类器官培养方式的改进，iPSCs向视网膜谱系的分化取得了重大进展。LANE 等［32］利用RP2基因突变敲除后诱导的iPSCs 和RP2 患者来源的iPSCs 培养成三维视网膜类器官作为视网膜疾病模型，并将iPSCs重编程、CRISPR基因编辑技术和腺病毒基因传递结合，通过比较等基因对照组、CRISPR敲除及腺病毒基因传递3 组疾病模型的视网膜外核层厚度和视紫红质免疫反应性，结果表明，腺病毒转导可拯救RP2敲除导致的视网膜外核层变薄并恢复视紫红质表达。遗传性耳聋-视网膜色素变性综合征2A（Usher syndrome 2A，USH2A）基因是常染色体隐性RP 最常见的相关基因，该基因变异引起非综合征型RP和综合征型RP（即USH 2型），前者常导致视力和听力损伤［33］。由于USH2A基因变异性较大，缺乏明确的基因型-表型相关或预后模型，使USH 2 型诊断较困难［33］。有研究在携带USH2A变异的3 名非综合征RP 和3 名USH 患者中进行了成纤维细胞、iPSCs 和iPSCs 衍生的视网膜类器官层面的研究［33］，结果表明，iPSCs 衍生的视网膜类器官中，非综合征型RP 的类器官杆状和锥状光感受器的内段和外段形成或延伸比USH 突变体更明显，通过基因校正后，来自非综合征型RP 的类器官杆状光感受器表型得到改善。

3.3 遗传性肝胆疾病 随着iPSCs 技术的发展，在体外生成胆管细胞已成为现实，这为研究肝胆疾病和再生治疗提供了可能。一些影响胆管细胞功能的单基因遗传性疾病，如常染色体隐性遗传的囊性纤维化和常染色体显性遗传的Alagille 综合征，影响胆道功能或造成胆管缺乏，使胆汁淤积、毒性物质累积，严重时可导致器官衰竭，造成严重胆道疾病的需进行肝移植，这类疾病造成的肝移植率小儿远高于成人［34］。无论是胆管疾病的研究还是胆管细胞再生治疗，均受到成熟胆管细胞培养技术的阻碍。OGAWA等［35］用单层分化培养，通过不同调节因子的筛选比较，确定了几种促进胆管细胞成熟的关键调节因子，如维甲酸、骨形态发生蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）、环磷酸腺苷和Rho 激酶通路，维甲酸诱导效果最明显。在小鼠骨髓基质细胞和无基质的培养基中分别加入维甲酸，结果发现，两种培养方式的囊性纤维化跨膜传导调节因子（cystic fibrosis transmembrane conduction regulator，CFTR）表达水平均升高，但单层培养中的CFTR 表达水平升高更突出［34］。这些调节因子使hiPSCs来源的胆管细胞表达高水平的CFTR，并含有初级纤毛结构［35］。另外，有研究采用iPSCs衍生的肝细胞样细胞模型对常染色体隐性高胆固醇血症（autosomal recessive hypercholesterolemia，ARH）进行研究［35］，该病是一种罕见的单基因疾病，由编码低密度脂蛋白受体（low-density lipoprotein receptor，LDLR）接头蛋白1（LDLR adaptor protein 1，LDLRAP1）基因的突变引起。该研究结合CRISPR／Cas9 技术建立敲除LDLRAP1基因的iPSCs，结果表明，敲除LDLRAP1或存在LDLRAP1突变的iPSCs 来源的肝细胞样细胞对低密度脂蛋白胆固醇的摄取降低。对于遗传性肝胆疾病导致的器官衰竭，器官移植是唯一的治疗方法。TAKEISHI 等［37］利用hiPSCs 分化为人肝细胞、胆管上皮细胞和血管内皮细胞，并组装成可用于移植的肝脏，具有与人类肝脏相似的组织结构。有研究将亮氨酸重复序列的G 蛋白偶联受体5 阳性的成人组织干细胞来源的单个肝脏类器官细胞在旋转瓶中进行大规模培养，这种条件下的干细胞能增殖分化为胆管细胞样和肝细胞样细胞，且这种大量细胞扩增技术获得的类器官可达到接近肝再生［38］。iPSCs 不仅是研究遗传性肝胆疾病的有力工具，iPSCs 衍生肝脏类器官的出现也为终末期肝胆疾病治疗提供了新思路。

3.4 进行性骨化性纤维发育不良症（fibrodysplasia ossifificans progressiva，FOP） FOP 是一种罕见的遗传性疾病，其特征是骨骼肌、韧带和肌腱等软组织的异位骨化（heterotopic ossifcation，HO）［39］。通常情况下，患者的HO不会在出生时出现，而是在儿童时期开始发展［39］，目前尚无有效治疗方法。约90%的FOP患者有激活素A型1受体（activin A type 1 receptor，ACVR1突变［39］，ACVR1基因在激活素-A 作用下错误地转导BMP 信号，并启动HO 的形成［40］。有研究对FOP 患者单核细胞检测发现，包括CD16+在内的几个表面标记物增加［41］。MAEKAWA 等［40］为研究激活素-A 对FOP 患者单核细胞的作用机制，利用来自FOP 患者和突变纠正FOP 患者的iPSCs 建立了永生单核细胞系，通过这些模型评估ACVR1突变对单核细胞的影响，结果发现，突变患者的iPSCs 单核细胞系表现出CD16+单核细胞的促炎特征，抑制素β 基因A表达上调，并发现白三烯的产量增加，而在激活素-A刺激诱导下，突变纠正的FOP患者iPSCs单核细胞系表现出与FOP 患者iPSCs 单核细胞系一致的初始炎性反应。FOP 患者iPSCs 单核细胞系准确再现了FOP 原代单核细胞的表型，与突变纠正的FOP患者iPSCs单核细胞系共同作为研究FOP 的HO 初始炎症阶段分子事件的疾病模型，且iPSCs在再生医学的应用上也有望为FOP患者提供细胞来源。有研究利用FOP患者的成纤维细胞建立了hiPSCs 分化形成软骨，并发现在矿化培养条件下，成软骨和成骨标记物表达均增加［42］。NAKAJIMA 等［43］利用iPSCs对FOP疾病建模，并利用FOP来源iPSCs诱导生成体细胞，将体细胞继续分化为衍生物生皮节、生肌节、生骨节等细胞，通过生骨节可诱导生成软骨细胞和骨细胞。hiPSCs 可衍生为类器官，能够进一步研究细胞与细胞之间的相互作用，因此，类器官将有望成为进一步研究ACVR1影响FOP发展的有利工具。

3.5 其他疾病 iPSCs 还可用来模拟结构性心脏病，如先天性左心发育不全综合征（hypoplastic left heart syndrome，HLHS）［44］。有研究用来自HLHS患者的iPSC衍生内皮细胞进行分析，结果表明，多个与心内膜功能和瓣膜结构重塑相关的信号通路受到抑制，包括血管内皮生长因子和Notch 信号通路。新生儿肺部疾病，如表面活性剂功能障碍的遗传性疾病，特别是具有明确的单基因（包括编码肺表面活性物质蛋白-B、肺表面活性物质蛋白-C、ATP 结合盒转运子的基因）驱动的疾病，已在使用hiPSCs进行体外研究，并尝试结合基因编辑治疗这类疾病［45-46］。

综上所述，基因编辑工具的结合及iPSCs衍生的脏器类器官发展，将极大推动遗传性疾病的疾病建模与个体化治疗的研究。

4 iPSCs应用的局限性

基因组不稳定性与涉及重编程过程和iPSCs 表观遗传变异的问题仍存在，使iPSCs的分化成熟存在一定障碍，还具有致瘤的可能性。在iPSCs培养过程中可能发生意外突变或修饰，潜在影响细胞分化和功能［14］，这种异常变异导致个体间变异将使iPSCs系之间出现异质性［47］。

iPSCs 的细胞替代治疗是将分化成熟的细胞制剂移植至患者体内，若将未分化的iPSCs直接注射至体内，由于未分化细胞的高增殖性和分化潜力，将导致畸胎瘤形成［1］。为了使iPSCs 在临床细胞治疗中不受致瘤性的限制，可将未分化细胞去除，如在培养基中添加高浓度L-丙氨酸，可选择性地将未分化细胞消除［48］。研究表明，水杨酸二胺也可选择性地将iPSCs 来源的心肌细胞制剂中残留的未分化细胞清除［49］。由于自体细胞可能携带致病基因［2］，产生特异性iPSCs所需时间长且价格高昂，同种异体移植可能优于自体移植，但同种异体移植存在人类白细胞抗原（human leucocyte antigen，HLA）不匹配问题。该项研究中，利用CRISPR／Cas9 系统将iPSCs 细胞的HLA-A和HLA-B等位基因同时打乱，产生保留HLA-C的iPSCs，结果发现，这种干细胞保留抗原呈递功能的同时，还能逃避T细胞和NK细胞的攻击［50］。

5 小结与展望

随着培养分化技术及重新编程方法的不断发展，iPSCs 技术在再生医学、细胞治疗、模拟人类疾病及药物筛选方面表现出明显的优势，而iPSCs在临床要得到广泛应用，必须与其他细胞治疗相关临床试验一样，需要确定致瘤性、剂量毒性、分布和免疫原性水平［5］。另外，iPSCs 的治疗效果必须先在患病动物模型上进行实验，确保和评估iPSCs 的安全性［5］。目前，已有超过14 种疾病和损伤细胞疗法已经或即将进行临床试验［51］。相信在不远的将来，iPSCs技术将在研究各种遗传性疾病的机制及探索治疗方法中得到广泛应用。