制药企业CNC区域微生物数据库的建立及微生物种群分析

张弛，张建玲，薛梅，律苗，李泷，李勤勤

北京生物制品研究所有限责任公司质量检定室，北京 100176

CNC（controlled not classified）区域即受控但未分级区域，该区域易于清洁，进出受控制且空气经过过滤，如人员进入一般生产区更衣需控制，该区域需处于受控状态；再如废弃物出口、气锁间、工艺支持区等［1］。FDA 相关法规指出，环境趋势数据揭示微生物从非控制区或较低级别区域到无菌操作间的迁移。建立充分程序，区分较低级别环境中的微生物，通常有助于检出这种趋势。应定期对这些辅助环境中的微生物进行物种鉴定［2］。随着国内外法规对于制药企业无菌保障水平要求的提升［3］，对CNC 区域进行微生物监测逐渐成为国际检查的关注点。

制药企业洁净区微生物分布及数据库的建立一直是关注的热点［4-8］，并探索使用新方法进行微生物鉴定［9-12］。但目前针对制药企业CNC 区域微生物分布的研究国内外均鲜有报道。在此背景下，本研究在国内首次对制药企业CNC区域的环境及人员进行微生物分布分析，建立CNC 区域的微生物分布数据库，并尝试与洁净区微生物分布进行比较，确定易进入洁净区的微生物菌群，评估清洁或消毒规程以及微生物检测方法的有效性，以期通过对CNC 区域微生物分布的研究实现对洁净区尤其是核心无菌操作区域的良好微生物控制，提升制药企业的无菌保障水平。

1 材料与方法

1.1 主要试剂及仪器 胰酪大豆胨琼脂培养基（tryptosesoya agar，TSA）和TSA 接触碟（含中和剂）购自浙江天杭生物科技有限公司；FSC-Ⅳ型浮游菌取样器购自PMS 美国粒子监测系统公司；Bio-Ⅱ-Advance生物安全柜购自西班牙Telstar公司。

1.2 取样点制定 以制药企业生产车间CNC 区域作为研究对象，按照生产人员、物料进入洁净区的路线，逐个CNC 区域进行浮游菌、沉降菌、人员和环境表面微生物取样。对包括换鞋间、总更衣间、一更间、走廊、缓冲间在内的10 个房间进行取样。浮游菌、沉降菌的取样点选择在CNC 区域的人员活动密集处；环境表面微生物选择对CNC 区域的门、墙、地面及物料表面等进行取样；人员表面微生物选择对进入生产车间的5 名人员进行取样，取样点包括人员的帽兜、左手、右手、胸腹部、左脚底部及右脚底部。

1.3 取样 人员、环境表面微生物取样按照《中国药典》四部（2020 版）9205 药品洁净实验室微生物监测和控制指导原则进行［13］。浮游菌的监测按照《医药工业洁净室（区）浮游菌的测试方法》的现行国家标准进行［14］。沉降菌的取样按照《医药工业洁净室（区）沉降菌的测试方法》的现行国家标准进行［15］；2022年1月对1个生产车间CNC 区域共取样2次，每次间隔1 周。采用FSC-Ⅳ型浮游菌取样器进行浮游菌取样。

1.4 微生物培养与纯化 取样后的胰酪大豆蛋白胨琼脂培养基平板（TSA培养基）置于20 ~ 25 ℃培养3 d，再30~35 ℃培养3 d。培养结束后，根据菌落形态、颜色、光泽、湿润度等判定平皿上的菌落类型并计数，每个平皿上单一类型菌落>50 CFU 的结果均按50 CFU 进行统计。采用三区划线法对菌落进行纯化。

1.5 微生物鉴别 采用16S rRNA测序法对细菌进行鉴别。霉菌根据其特有的形态特征直接进行判别。

1.6 统计学分析 采用Excel 进行数据统计，使用Microbiomeanalyst在线分析软件［16］进行数据分析。

2 结果

2.1 生产车间CNC 区域微生物分离 2 次取样分别分离到1 843、2 237 株微生物，浮游菌、沉降菌、环境和人员表面微生物分离菌株见表1。表明CNC 区域存在丰富的微生物，浮游菌的数量较其他3 项监测数据略低。

表1 2次CNC区域取样分离菌株数Tab.1 Strains isolation results of twice sampling from CNC area

人员表面微生物分布情况见表2。2 次CNC 区域取样均分离到丰富的微生物。人员不同取样位置微生物数量存在差异，其中人员帽兜、胸腹处微生物数量相对少，手部、脚底部微生物数量多。

表2 2 次CNC 区域取样人员表面微生物监测结果（CFU／平皿）Tab.2 Personnel surface microbial monitoring results of twice sampling from CNC area（CFU／plate）

2.2 生产车间CNC区域微生物分布 2次CNC区域取样共分离到47 个属的微生物，革兰阳性菌所占比例为84.4%，革兰阴性菌所占比例为15.6%。其中不动杆菌属占总体比例为9.3%，其他革兰阴性菌占总体比例仅为6.3%。葡萄球菌属、微球菌属、不动杆菌属、微杆菌属、芽孢杆菌属所占比例最大，占总体比例的79.9%。CNC区域微生物总体分布见图1。

图1 CNC区域微生物菌属总体分布图Fig.1 Overall distribution of microorganism genera in CNC area

通过对2 次CNC 区域浮游菌、沉降菌、环境和人员表面微生物分布进行比较，发现葡萄球菌属在浮游菌、沉降菌、环境和人员表面广泛分布，且所占比例最大，其中尤以人员表面最为突出，2 次取样人员表面葡萄球菌占比分别为86.4%和84.3%；微球菌属的分布比例仅次与于葡萄球菌属，在浮游菌、沉降菌、环境和人员表面均有分布；不动杆菌属是在浮游菌、沉降菌、环境和人员表面分布最广泛的革兰阴性菌；微杆菌属和考克菌属主要在浮游菌、沉降菌、环境表面分布；芽孢杆菌属在浮游菌、沉降菌、环境和人员表面均有分布，但人员表面分布比例较低。见图2。

图2 2次CNC区域取样微生物菌属分布比较Fig.2 Comparison of microbial distribution of twice sampling from CNC area

从微生物分类中种的水平对2 次CNC 区域取样浮游菌、沉降菌、环境表面微生物分布、人员表面微生物分布进行统计，表明在浮游菌、沉降菌、环境表面微生物以表皮葡萄球菌、科氏葡萄球菌、沃纳利葡萄球菌、人葡萄球菌、溶血葡萄球菌、鲁氏不动杆菌、琼氏不动杆菌等为主；人员表面微生物以沃纳利葡萄球菌、科氏葡萄球菌、表皮葡萄球菌、人葡萄球菌、溶血葡萄球菌、腐生葡萄球菌、云南微球菌等为主。见表3和表4。

表3 2次CNC区域取样浮游菌、沉降菌、环境表面微生物菌种分布统计Tab.3 Distribution statistics of airborne microorganisms，settling microorganisms and environmental surface microorganisms in twice sampling from CNC area

表4 2次CNC区域取样人员表面微生物菌种分布统计Tab.4 Distribution statistics of personnel surface microorganisms in twice sampling from CNC area

对2 次CNC 区域取样微生物分布的多样性进行统计，以Alpha多样性指数表征浮游菌、沉降菌、环境和人员表面微生物的种群丰富度，结果表明，浮游菌、沉降菌的微生物种群丰富度最高，环境表面微生物次之，人员表面微生物种群丰富度最低。见图3。

图3 CNC区域微生物分布多样性Fig.3 Distribution diversity of microorganisms in CNC area

2.3 CNC 区域与同生产车间洁净区的微生物分布比较 将2 次CNC 区域微生物分布与该生产车间1年内B、C 级洁净区的微生物分布进行比较，结果表明，近1 年内该车间B、C 级洁净区共收集到25 个菌属的微生物，绝大部分包含在CNC 区域微生物种群中，只有分枝杆菌属和纤维单胞菌属在CNC 区域中未发现（未发表数据）。B、C 级洁净区与CNC 区域类似，均以葡萄球菌属、微球菌属为主。B 级洁净区由于采取更为严格的人员、物料进出程序和更为频繁的消毒措施，尚未发现芽孢杆菌。不动杆菌属在B、C 级洁净区的分布比例较CNC 区域有所下降。鞘氨醇单胞菌属在B、C级洁净区的分布比例较CNC区域有所提升。见表5。

表5 生产车间B、C级洁净区与CNC区域微生物分布（%）Tab.5 Distribution of microorganisms in Class B and C clean areas and CNC area of sampled production workshop（%）

3 讨论

通过对生产车间2 次CNC 区域微生物取样及菌种鉴别，发现生产车间CNC区域以革兰阳性菌为主，革兰阴性菌所占比例较少。疫苗生产CNC区域微生物种类非常丰富，在2 次取样中共分类到47 个属的微生物，按照属进行分类，2 次取样结果重合率为63.8%。革兰阳性菌以葡萄球菌、微球菌、微杆菌属为主，革兰阴性菌以不动杆菌属为主，与已报道的洁净区微生物分布类似［4-8］。

葡萄球菌属是CNC区域分布数量最多的一类微生物。微球菌属和葡萄球菌属同属于微球菌科，其分布比例仅次于葡萄球菌属。CNC 区域存在一定比例的芽孢杆菌，而芽孢的存在足以对洁净区的微生物控制构成威胁［17-18］。因此，人员、物料由CNC 区域进入洁净区前采取严格的进入流程和针对葡萄球菌属、微球菌属、芽孢杆菌属的有效消毒程序有利于洁净区的微生物控制。

另一类值得引起关注的微生物为不动杆菌属，该属是CNC区域分布数量最多的革兰阴性菌。通过对2 次监测结果的统计，不动杆菌属出现的频次较低，但总菌落数高，具有菌落聚集出现的特点。根据此结果结合不动杆菌的生长特性，分析原因为不动杆菌黏附力极强，易在各类材料上黏附，而可能成为贮菌源，从而造成长菌区域形成多个菌落。不动杆菌属在CNC区域的分布特点可解释B、C级洁净区不动杆菌属所占比例明显下降。

将CNC区域微生物分布与同生产车间B、C级洁净区微生物分布进行关联分析，发现近1 年内洁净区分离到的微生物与CNC 区域具有极高的重合率，洁净区中只有分枝杆菌属和纤维单胞菌属在CNC区域中未发现，分析原因为2 次CNC 区域微生物取样并未捕获CNC 区域的全部微生物。相较于CNC 区域，洁净区的微生物菌属减少了22 个，表明各级别洁净区空调系统运行、定期的清洁消毒措施、不同洁净级别人员的更衣流程、物品进入车间的退包／消毒措施有效阻止了一部分微生物进入洁净区。高重合率也说明洁净区监测到的微生物来源于CNC 区域，因此，生产车间实现对CNC区域微生物的良好控制可提高洁净区域的微生物控制水平。

人员是洁净区最大的污染源［19］。在CNC区域人员身着白色洁净服、穿一次性袜子，手部裸露的情况下对10 名人员的表面微生物进行监测，发现人员帽兜和胸腹部微生物数量相对较少，脚底和手部微生物数量较多。人员表面微生物种类相对较少，且葡萄球球菌占绝对优势。该结果表明，生产人员的个人清洁卫生以及在更衣前对手部进行充分的清洁消毒对于洁净区微生物的控制非常重要［19］。另外，对于此次监测发现的人员脚底微生物数量众多应引起关注，因为脚底部的微生物存在透过洁净服污染洁净区的风险，可采取穿洁净拖鞋或洁净服脚底部选用避免微生物渗透的材质等方式减少生产人员脚部微生物对洁净区的污染。

通过对疫苗生产车间CNC区域进行微生物监测掌握了疫苗生产车间CNC 区域的微生物分布特征，并了解了需重点关注的主要微生物种群。CNC 区域微生物监测同时也有利于对洁净区环境监测微生物超标事件进行追溯和调查。通过与B、C 级洁净区的微生物分布进行对比，证实了洁净区内环境菌来源于CNC 区域，确定了易进入洁净区的微生物种群。据此制定更具针对性的清洁消毒程序，优化人员更衣流程等措施，有助于提升洁净区的微生物控制及疫苗生产的无菌保障水平［20-21］。

此次CNC 区域微生物分布研究仅针对1 个疫苗生产车间在短时间内进行取样。CNC 区域微生物分布规律随时间和季节的变化，以及不同生产车间CNC 区域微生物的分布是否存在差异尚有待研究。后续将按照不同季度对多个生产车间进行CNC区域监测，收集数据，为建立CNC区域微生物监测合格标准提供依据。