关于预防性人用疫苗企业标准物质的思考

王一平，赵宗阁，吴星，2，梁争论，2，毛群颖，2

1.中国食品药品检定研究院，北京 102629；2.国家卫生健康委员会生物技术产品检定方法及其标准化重点实验室，北京 102629

疫苗企业标准物质涉及疫苗研发、生产和评价，是保证疫苗产品质量的关键，其类别包括生物标准物质（标准品、参考品）、对照品和滴定标准液等。本文所述的企业标准物质是指疫苗企业用于生物效价／活性、含量测定或其特性检查的工作标准物质，依据《中国药典》三部（2020版）规定，如有国家标准品，则必须经国家标准物质标定后方可使用［1］。其中，标准品含量以质量单位（g、mg、μg）表示，生物学活性或效价以国际单位（IU）、特定活性单位（AU）及活性单位（U）表示，参考品以特定活性单位（AU）及活性单位（U）表示，而对照品和滴定标准液用于理化项目检测，前者为用于生物制品理化等方面测定的特定物质，多按干燥品（或无水物）进行计算后使用。

在疫苗标准物质相关法规和指南等文件中，世界卫生组织（World Health Organization，WHO）指导原则和《中国药典》主要关注WHO 国际标准物质和国家标准物质的研制和应用［2-6］；国家药品监督管理局（National Medical Products Administration，NMPA）颁布的预防用疫苗临床前研究技术指导原则、人用药品技术要求国际协调理事会（International Council for Harmonisation of Technical Requirements for Pharmaceuticals for Human Use，ICH）发布的Q6B 指导原则均为对新药研发企业标准物质的概括性技术要求；NMPA 药品生产质量管理规范（Good Manufacturing Practice，GMP）、WHO GMP、欧盟（European Union，EU）GMP和美国食品药品监督管理局（Food and Drug Administration，FDA）GMP 等均为对标准物质在疫苗生产阶段的管理要求。国内和国外GMP关于标准物质的使用要求均未对疫苗等生物制品标准物质进行特别细化规定，但近年来WHO 制订的标准物质研制手册对三级（企业）标准物质提出了包括原材料、标定设计、统计学和稳定性等明确技术要求［4，7］，2023年我国还提出了生物制品国家标准物质应基于风险评估进行生命周期管理的理念［8］，这些文件均对我国企业疫苗标准物质管理具有较强的指导意义。

COVID-19 疫情加速了我国疫苗行业的发展，涌现多个应用mRNA、新佐剂重组蛋白及腺病毒、流感病毒载体等新型技术平台和新兴疫苗企业，这对企业及国家疫苗标准物质的研制和应用提出了挑战，如针对以理化和仪器检定为主，结合生物活性和效价检测的mRNA 疫苗，如何建立基于风险控制全生命周期管理的企业疫苗标准物质，有效质控疫苗的纯度、杂质、活性以及评价疫苗免疫原性等问题［9-11］。本文在调研部分疫苗企业生物标准物质的基础上，结合WHO、ICH指导原则和生命周期等新理念，提出企业疫苗标准物质应关注的要点，建议制定我国预防性人用疫苗企业标准物质指导原则，为整体提升我国企业疫苗标准物质水平提供思路。

1 企业疫苗标准物质

目前WHO 公布的生物标准物质中疫苗类标准物质共111 个［12］，我国批准使用的疫苗类国家标准物质共114 个［13］，《中国药典》三部（2020 版）收录的疫苗类标准物质为42个［14］。在存在WHO及国家标准物质情况下，疫苗企业应使用国家标准物质或使用国际标准物质标化企业标准物质；在WHO 及国家标准物质不可及时，企业应依据《中国药典》三部（2020版）要求，自行建立工作标准物质以控制和评价疫苗质量，并按国家药品监督管理局药品审评中心（Center for Drug Evaluation，CDE）要求，在新药申请（New Drug Application，NDA）时提供国家标准物质候选原料。

企业疫苗标准物质又可分为外购标准物质及自建标准物质两类。外购标准物质中，一类为活性／效价以及生物残留检测的标准物质，购自中国食品药品检定研究院（National Institutes for Food and Drug Control，NIFDC），该类标准物质的质量监测由NIFDC负责，企业需按说明书保存和使用；另一类为外购的商业化试剂盒中自带的标准物质，如牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）残留量检验试剂盒中自带BSA 标准品，宿主Vero 蛋白残留量检测试剂盒自带Vero 蛋白残留量标准品，该类标准物质质量监测由商业化公司负责。疫苗企业自建标准物质也可分为两类，一类溯源至国家标准物质，另一类为企业自行赋值或定值，后者多用于企业特有产品的质量控制，如企业产品活性或效价以及特有成分、纯度或杂质检测等。依据《中国药典》三部（2020版）人用疫苗总论，疫苗企业自建标准物质的制备、标定和保存应符合“生物制品国家标准物质的制备和标定”的相关要求［6］。

2 企业疫苗标准物质应遵守的相关法规和指导原则

疫苗标准物质相关法规和指导原则包括WHO技术文件、现行版《中国药典》三部、四部，NMPA 及其直属单位的相关指导原则，以及ICHQ6B 及GMP等文件。

2.1 WHO 规程对企业标准物质（三级标准物质）的相关要求 WHO在2017和2022年分别发布了“核酸和抗原类诊断试剂标准物质研制手册”和“抗体二级标准物质研制手册”，均列表进行了一级（国际）、二级（国家）和三级（工作及其他）标准物质各自的特性比较［4-5，7］，提出候选原材料应与待测分析物性质尽可能一致，可使用与待测样品相似的原材料制备；剂型可为液体、冻干或干燥样品；标定为由有限数量实验室使用单个检测方法或有限数量的不同方法／平台进行的小型研究，通过协作标定研究与国家标准品进行溯源，要求标定结果包括不确定度（measurement uncertainty，MU）等要求。

2.2 《中国药典》标准物质通则及疫苗总论《中国药典》三部（2020版）通则“生物制品国家标准物质的制备和标定”，对生物制品国家标准物质提出了明确的技术要求，包括原材料、制备、检测、标定以及稳定性、保存分发和换批等。《中国药典》三部（2020 版）人用疫苗总论对企业疫苗标准物质指出，标准物质的制备、标定和保存应符合“生物制品国家标准物质的制备和标定”的相关要求。

2.3 对上市阶段疫苗标准物质的管理要求

2.3.1 我国GMP 文件 GMP（2010 年修订）规定，药品企业应当建立工作标准品或对照品的质量标准以及制备、鉴别、检验、批准和贮存的操作规程，每批工作标准品或对照品应用法定标准品或对照品进行标化，并确定有效期，应通过定期标化证明工作标准品或对照品的效价或含量在有效期内保持稳定，未提出对疫苗类等生物制品标准物质的特殊细化要求［15］。2020 年增加的生物制品附件中，未对生物制品标准物质进行修订［16］。2023 年发布的GMP 指南未明确对工作标准品的细化管理要求［17］。

2.3.2 国外GMP 文件 WHO GMP 技术指南附录2（Technical Report Series 986）和EU GMP指南第4卷中，关于标准物质的管理要求基本一致，规定当存在官方标准物质时优先考虑使用官方标准物质，且依据其目的进行使用。当需要制备三级标准物质时，需要采用合适的方法对三级（工作及其他）标准物进行充分验证并保证可追溯性，同时进行定期监测。标准物质储存时应对标准物质的重要信息进行标注，以确保标准物质有效［18-19］。美国FDA 要求保存关于标准物质的制备及验证完整记录［20］。与我国GMP要求类似，国外GMP 关于标准物质的使用要求也未针对疫苗等生物制品标准物质制定细化要求。

2.4 对研发阶段疫苗标准物质的技术要求

2.4.1 我国预防用疫苗临床前研究技术指导原则要求企业应在疫苗研发阶段考虑研究、建立稳定工艺后的疫苗抗原参考品，以及疫苗效力、免疫原性检测用标准品或参考品［21］。疫苗抗原参考品与其后生产多批次疫苗的质量控制指标的比对，可了解在上市后生产的疫苗抗原较研发阶段的抗原在质量上有无改变。疫苗效力、免疫原性检测的标准品或参考品可用于疫苗效力指标的质量控制。

2.4.2 CDE相关指导原则

2.4.2.1 SARS-CoV-2 预防用疫苗研发技术指导原则（试行） 要求应提供建立的参考品或对照品来源、制备、检定结果、标定过程及稳定性研究（定期复检）等方面的初步研究资料［22］。

2.4.2.2 SARS-CoV-2 预防用疫苗非临床有效性研究与评价技术要点 应提供建立的参考品或对照品（包括用于核酸含量、纯度和生物活性，包括全序列测定）来源、制备、检定结果、标定过程及稳定性研究（定期复检）等方面的初步研究资料［23］。

2.4.2.3 多肽疫苗生产及质控技术指导原则 提出选取合适的1 批中间产品及终产品（最好是选择经过临床评价的制品），就其化学成分、纯度及生物学活性进行全面检定，而后保存下来作为化学或生物参考品，可依此制定每批产品的标准要求［24］。

2.4.3 ICH Q6B 提出企业标准物质应分级管理，主要参考物质为企业用代表批次制备的经质量特性分析的物质，用于各批产品的生物学检测和物理化学试验，并用于内部工作参考物质的标定，创新药注册申请的生产商应建立由采用生产和临床研究用样品的代表性批次制备的主要参考品。对产品相关物质、产品相关杂质和工艺相关杂质也应考虑分别建立参考品［25］。

3 企业疫苗标准物质研制、使用和管理

3.1 企业疫苗标准物质研制和管理方面存在的问题

本次调研的疫苗企业包括mRNA 疫苗、重组蛋白疫苗、灭活疫苗和减毒活疫苗等生产单位。企业均依据GMP 要求建立了企业疫苗标准物质管理规程，对外购和自建标准物质进行管理。

3.1.1 应加强对标准物质相关法规指南的学习和理解 本次调研发现企业制定标准物质管理规程主要依据《中国药典》三部（2020 版）、四部（2020 版）和我国GMP 2010 修订版，其中对《中国药典》三部（2020版）人用疫苗总论中规定的标准物质制备、标定和保存应符合“生物制品国家标准物质的制备和标定”的相关要求，企业应做到将药典标准物质要求的精神与企业标准物质实际结合，学习理解近年WHO 提出的生物制品标准物质的新理念，并提升对标准物质标定概念的理解。在标准物质标定方面，目前较多的企业表现为将标定与检定混为一谈，认为标定是多人多次检测，结果应符合规程规定，不符合规定的按偏差处理。

3.1.2 我国GMP 相关文件对疫苗标准物质的适用性 国外GMP 相关标准物质的规定均对标准物质的概括性管理提出要求，强调当需要制备企业标准物质时，需要采用合适的方法对标准物质进行充分验证保证可追溯性，并进行定期质量监测。

我国GMP 2010 修订版中标准物质的相关规定，要求通过定期标化来证明标准物质的效价或含量在效期内保持稳定。这一条款对于生物制品特别是疫苗标准物质的适用性值得商榷。在2023 年发布的药品GMP指南文件中，未再提及对标准品的要求。因此疫苗企业应思考如何合规并科学建立和使用标准物质。

3.2 提升疫苗企业标准物质管理水平的思考

3.2.1 原料选用 对于研发中的制品（WHO 国际标准物质和国家标准物质不可及时），疫苗企业应自行建立2 个不同级别的标准物质，特别是抗原标准物质。ICH 提出在申报时企业标准物质应建议采用生产和临床研究用样品的代表性批次，制备经过质量特性分析的高级别工作标准物质和用于产品批检验的低级别工作标准物质，后者应使用高级别标准物质标定。可首先考虑应用毒理批建立初步的质控品，其后应用临床经过有效性和安全性研制的批次建立标准物质，用于后续批次疫苗的质控。

3.2.2 剂型 企业标准物质一般不采用冻干剂型，但非冻干的疫苗标准物质可能换代或换批频繁，不利于保证量值持续准确的传递，因此较为适宜的方法为在工艺优化完成后，选择工艺稳定，具有典型代表性批次制备标准物质，作为企业高级别标准物质低温长期保存（通常-70 ℃以下），作为后续标准物质换代或换批时的基线。

3.2.3 分装精度和均匀性 WHO国际标准物质的分装精度要求小于±1.0%，生物制品国家标准物质分装精度同样要求小于±1.0%。分装精度对冻干的标准物质尤为重要，同时也对分装设备要求较高，多数企业高分装精度设备不可及，在实际中企业标准物质按产品分装的精度也可接受。均匀性是标准物质的基本属性，虽然对于液体标准物质均匀性一般较理想，但对于含铝佐剂等混悬制品的标准物质，建议采用精密度高的方法进行均匀性检测，以满足标准物质研制要求。

3.2.4 标定 企业疫苗标准物质的标定目的是为给标准物质准确赋值，依据标准物质研制原则，企业疫苗标准物质应溯源至国家标准物质或WHO 国际标准物质。需由有资质的人员通过不同次数或不同人员与国家或WHO 国际标准物质同时进行标定试验，由统计学专家通过有效的统计模型获得标定结果及MU，生物制品类标准品可采用95%可信限作为MU。

对标定次数，《中国药典》规定生物制品国家标准物质的协作标定至少3 家实验室，每家提供具有5次以上独立有效结果，WHO 则指出要保证足够的独立实验次数。对于企业标准物质可采用单一实验室或少数实验室进行足够次数检测，以保证标定符合统计学要求。目前企业在标定实验次数规定上相差较大，建议企业在标定时应依据标准物质的特性以及检测方法的变异度确定人员和检测次数，应用适合的统计学模型对每次检测结果采用线性或非线性平行性分析进行计算，并证明统计模型的有效性，全部结果再通过统计分析，以获得标定物质的最终标定均值和MU。

3.2.5 稳定性研究和监测 稳定性为标准物质的另一关键质量属性。疫苗标准物质的稳定性可基于疫苗产品的稳定性进行评估，在有国家或国际标准物质时，以国家或国际标准物质为依据，当没有国家或国际标准物质时，企业应以内部高级别工作标准物质为依据进行稳定性研究，包括加速稳定性考核和实时长期稳定性监测。

需关注的是，采用单抗等免疫学方法检测疫苗标准物质的稳定性，可能出现加速后稳定性升高的现象，分析可能为抗原结构改变，充分暴露出单抗的结合位点。因此研制特异、准确及敏感的稳定性检测方法是疫苗及疫苗标准物质稳定性研究的前提。

3.2.6 效期 WHO国际标准物质和生物制品国家标准物质不设效期，企业可依据生物制品特性和稳定性考核数据预设效期，但应在预计效期内持续进行稳定性监测，设立稳定性下降预设标准。

3.2.7 表征 WHO指南建议对疫苗标准物质进行表征研究［2］。如对新研制的SARS-CoV-2 mRNA 疫苗，WHO 要求在申请上市许可时提供标准物质信息，选择充分表征结构、纯度和生物活性，经过临床试验评估的批次作为候选标准物质原料。《中国药典》三部（2020版）人用疫苗总论未对疫苗标准物质提出表征要求，而人用重组单克隆抗体制品总论提出选择适当或代表性批次用于各种分析，并应进行全面分析鉴定标准物质。近期CDE颁布的溶瘤病毒产品药学研究与评价技术指导原则提出［26］，标准品／对照品应开展全面的质量研究、标定和稳定性研究。建议对用于疫苗效价或抗原检测的标准物质进行全面表征，了解标准物质的降解模式，在此基础上研究稳定性敏感的检测方法，用于标准物质稳定性监测，以及建立模型预测标准物质的有效期。

3.2.8 标准物质的生命周期 企业应结合基于风险评估的全生命周期标准物质管理理念［8］，对标准物质原材料、制备、标定、保存、使用、换代换批及停用的各个环节进行风险评估，分析标准物质生命周期不同阶段存在的风险点，提出相应的风险控制措施，以保证标准物质的准确性。重点关注均一性、稳定性、协作标定以及赋值准确性，保证企业标准物质的量值准确传递，建议开发稳定性敏感的检测方法用于稳定性评估和监测，为疫苗质控和评价提供可靠的标尺。

4 小结

企业疫苗标准物质对保证疫苗制品的质量发挥重要作用。近年，我国多个mRNA、新佐剂重组蛋白及腺病毒、流感病毒载体等新型疫苗品种的出现，对疫苗标准物质的研制和应用提出了挑战。为适应生物制品发展需要，WHO 对企业（三级）标准物质的关键质量属性提出了新的技术要求。本文在对疫苗企业调研基础上，归纳总结了疫苗类标准物质相关的法规和指南性文件，分析了企业疫苗标准物质存在的问题，建议企业应理解并正确应用生物制品标准物质相关法规和指南文件，并制定企业疫苗标准物质制备和应用的指导原则。