终末期肝病合并真菌感染诊断现状与未来*

黄蓝月 刘芸辉 程秋瑜 钮雨鑫 刘婷婷 张 梦 朱 琳 宁 琴 陈 韬

华中科技大学同济医学院附属同济医院感染科,人畜共患传染病重症诊治全国重点实验室 (湖北 武汉, 430030)

终末期肝病(ESLD)至今仍无严格定义,其范畴包括各种慢性肝病的终末期阶段,包括慢加急性肝衰竭、肝硬化急性失代偿、慢性肝衰竭和肝细胞癌[1]。慢性肝病最常见病因是乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒、酒精性肝病和非酒精性(代谢相关性)脂肪性肝病,在亚洲国家(除日本以外),慢性HBV感染是其主要病因[2]。其中,真菌感染既是慢性肝病患者进展为ESLD最常见的触发因素,也是ESLD患者最常见的并发症之一。侵袭性真菌感染(IFI) 是指侵犯至人体深部组织器官的真菌感染,导致组织损害、器官功能障碍和炎症反应等病理改变及病理生理过程。2.5%～10%肝衰竭患者合并IFI[3]。已有真菌培养以及真菌特异性抗原检测/血清曲霉特异性抗原(G/GM)试验等真菌检测应用于临床实践,但是由于ESLD疾病的特殊性,其诊断价值尚存在一定的局限性。

1 ESLD合并真菌感染的流行病学

在ESLD合并真菌感染的患者中[4],侵袭性念珠菌病(IC)是最常见的IFI类型,其次是侵袭性曲霉菌病(IA)。研究表明[5],IC中,白色念珠菌(72.4%)最为常见;而IA中,菌株以烟曲霉(79.5%)为主。ESLD合并真菌感染加剧炎症级联反应,导致肝脏及肝外器官衰竭。大型荟萃分析表明,肝硬化合并IC和IA的死亡率分别高达55%[6]和81.8%[7]。ESLD患者IFI的好发部位依次为肺(3.9%)、泌尿道(2.6%)、血流(1.9%)、腹腔(1.7%)、肠道(1.7%)和神经系统(0.9%)[5]。

1.1 呼吸道 肺部真菌感染最常见的类型是侵袭性肺曲霉病(IPA),还包括毛霉菌病、肺孢子菌肺炎和肺念珠菌病等[8]。

1.2 泌尿道 泌尿系统的真菌感染大多数为念珠菌所致[9],白色念珠菌占50%～70%,其次为光滑念珠菌、热带念珠菌。泌尿道真菌感染常无典型症状。

1.3 血流 念珠菌引起的真菌血症是ESLD患者中最常见的IFI[10],白色念珠菌最为常见,其次为热带念珠菌、光滑念珠菌。临床表现从轻度发热到脓毒症不等。

1.4 腹腔 自发性真菌性腹膜炎在ESLD常见,白色念珠菌是从腹水中最常分离出的菌种[11],其特征是腹水真菌培养阳性,腹水中性粒细胞计数低于250个细胞/mm3,常合并细菌感染。临床表现与自发性细菌性腹膜炎难以区分,腹膜刺激征不典型,可有淡红色血性腹腔积液。

1.5 肠道 肠道真菌感染可表现为发热、腹胀、腹泻和豆渣样大便[12]。肠道真菌感染以白色念珠菌最为常见,其次为热带念珠菌。

1.6 神经系统 神经系统的真菌感染较为少见,隐球菌性脑膜炎最为常见,典型症状包括颈强、发热、畏光和呕吐[13]。

2 ESLD合并真菌感染的诊断方法

ESLD合并真菌感染的诊断主要依据真菌微生物学检查证据、宿主因素及临床表现,分为确诊、临床诊断、拟诊3类[14]。临床确诊主要依据真菌微生物学检查结果,但阳性检出率尚不能满足临床需要,相关替代检验指标受到ESLD影响,其具体临床应用需进一步优化。

2.1 微生物培养 念珠菌血症的金标准是血培养,但其灵敏度为63%～83%[15]。原因可能是血液中缺乏活念珠菌、活念珠菌浓度不足以在收集的样本中检测到或活细胞间歇性/短暂释放到血液中[16]。念珠菌的繁殖速度慢,其培养阳性时间需要72～96 h。

深部念珠菌病诊断的金标准是无菌收集的感染组织培养物(胸腔积液、腹腔积液、脑脊液等)培养阳性。直接从感染培养念珠菌的深部部位采集样本,往往需要侵入性操作,组织培养敏感性低于50%[16],这可能与念珠菌浓度低、分布不均有关。

IA最常见的类型为IPA,通过痰培养或支气管肺泡灌洗术(BAL)获得的呼吸道标本培养是诊断的金标准,但是该方法存在以下问题:标本不易获得,获取标本常需要侵入性操作(支气管肺泡灌洗、肺活检、支气管活检等)。通过痰培养或BAL获得的呼吸道标本培养的阳性预测值较低(约72%),在已经接受抗真菌治疗的患者中可能更低[17]。BAL培养阳性可能反应的是定植而不是感染。

使用微生物培养来诊断IFI存在敏感性差、耗时长、标本难以获取、难以区分定植与感染等问题,不宜作为早期诊断的手段,诊断时进行治疗往往为时已晚。ESLD患者出现抗菌治疗无效的发热/寒战、胆红素不降反升等临床表现时,积极连续留取足量血液和体液标本(痰液、腹水、胆汁等),并及时处理以防止细菌和酵母菌过度生长,必要时使用特定培养基/特殊染色以提高IFI的诊断准确率。

2.2 特殊染色检查 显微镜检查是诊断IFI的方法之一,但是该检查的敏感性低,主要因为其需要更高的真菌丰度[18]。荧光染料(如Calcofluor WhiteTM或BlancophorTM)染色具有灵敏度高、周期短和适用性广等优点,但对曲霉菌的染色不具有特异性。Gomori的乌洛托品银染和高碘酸希夫可用于组织学切片和涂片,可应用于IA的诊断。

2.3 特异性抗原检测 真菌特异性抗原检测[19],简称G试验,是基于血清中(1,3)-β-D-葡聚糖(BDG)的检测方法。BDG是真菌(念珠菌、曲霉菌、耶氏肺孢子虫等)的细胞壁成分,但在毛霉菌和大多数隐球菌中并不存在,在细菌、病毒以及哺乳动物中也不表达。成人BDG≥80 pg/ml被定义为阳性。虽然G试验能够用于IFI的诊断及抗真菌治疗疗效评估,其缺点也不容忽视:无法用于隐球菌诊断、不能鉴定具体的菌属和菌种以及假阳性高。既往研究显示,G试验假阳性的原因可能与人血液制品输入(免疫球蛋白、白蛋白)、纤维素膜血液透析、使用阿莫西林-克拉维酸或哌拉西林-他唑巴坦等抗生素、严重细菌感染、肠内营养等因素有关[20]。

血清曲霉特异性抗原检测,简称GM试验。半乳甘露聚糖是曲霉菌属的细胞壁成分,真菌生长和侵入组织时释放,可通过平板曲霉酶免疫测定检测。GM≥0.5 ng/ml被定义为GM试验阳性,被认为是曲霉菌病的真菌学证据,但易出现假阳性反应。当接受阿莫西林-克拉维酸和哌拉西林-他唑巴坦、含葡萄糖酸盐的血浆、血液衍生产品治疗,或与其他霉菌和二态性真菌(例如青霉菌等)发生交叉反应可致假阳性,无法用于毛霉菌的诊断[21]。

ESLD常使用抗生素治疗,住院期间输入血制品(人工肝治疗、白蛋白、血浆等),将会影响ESLD患者G/GM试验诊断特异性。可在患者入院后动态观察血液G/GM试验检验结果,以降低该检查的假阳性率。一项ACLF合并IFI的回顾性分析显示,BDG和GM诊断IFI的灵敏度、特异性和曲线下面积分别为97.4%、60.0%、0.770和43.6%、100%、0.745[4]。

G/GM试验联合检测能更好地排除假阳性,有助于IA的诊断。一项荟萃分析评估了G/GM联合试验在免疫功能低下的成年IA患者中的诊断效用,结果显示,虽然敏感性降低为49%,但其特异性为98%[22]。由此可见,同时检测G/GM试验可提高诊断IA的特异性。

2.4 分子检验 聚合酶链式反应(PCR)作为IFI的辅助诊断手段,可用于检测全血、血清、血浆、脑脊液或 BAL 中的真菌,为鉴定对抗真菌治疗有耐药性的真菌菌株提供了一种非培养替代方法,与其他诊断方法相结合可以提高IFI的诊断效能,同时也是毛霉菌唯一的非培养实验室检测方法[23]。该技术目前最主要的问题是标准化程度有限,检测到死亡微生物的DNA易致临床假阳性结果。PCR连续阳性对IA的诊断具有良好的特异性,但尚未在ESLD患者中验证。

2.5 宏基因组二代测序(mNGS) mNGS也称为高通量测序,它可以应用于各种标本类型,包括血液、支气管肺泡灌洗液、脑脊液、痰液、尿液等。它仅需从样本中提取少量的脱氧核糖核酸(DNA)/核糖核酸(RNA),便可以检测和鉴定病原体,可检测出罕见、新型、难以检测的病原体,同时具备耐药性评估的能力[24]。但mNGS的超灵敏性会导致病原体与其他微生物(背景菌群、污染菌群、定植菌群)的鉴别困难,从而使得临床解读缺乏标准。伴有感染性腹水的ESLD患者,由于肠道菌群改变、细菌易位等因素,使得mNGS难以发挥其高效、快速的检测价值[25]。

2.6 其他检测方法 T2念珠菌纳米诊断组合使用T2磁共振和专用仪器平台直接扩增和检测(使用带有靶探针的纳米颗粒)全血中的念珠菌DNA,即使患者正在接受抗真菌治疗,该技术仍能灵敏检测出念珠菌[26]。该方法可以在大约5 h内从全血中快速识别出5种最普遍的念珠菌(白色念珠菌、热带念珠菌、副念珠菌、克鲁塞念珠菌和光滑念珠菌)和无法检测到少量的耳念珠菌[27]。T2念珠菌纳米诊断组合与传统血培养技术相结合可以显著提升IC的诊断效率,但其诊断效能仍有待验证。

将PCR与质谱技术结合的基质辅助激光解吸电离-飞行时间-质谱以及PCR-电喷雾电离质谱技术避免了对无限制引物的要求,可快速检测及定量相对广泛真菌病原体,有望于近几年内被大规模应用于临床微生物实验室[28]。

曲霉特异性侧流装置(LFD)是一种免疫层析测试,它使用JF5单克隆抗体检测活跃生长的曲霉菌分泌的细胞外糖蛋白(甘露蛋白)抗原。LFD用于BAL样本诊断IPA受全身性抗真菌预防/治疗的影响较小,但仍需更多的临床样本进行验证[29]。

曲霉邻位结扎试验是将抗原(曲霉特异性细胞外甘露蛋白)抗体识别的特异性与实时荧光定量PCR检测的灵敏度相结合,从而用于曲霉菌的早期检测。该方法与其他真菌属抗原无交叉反应,或可用于诊断IA[27]。

综上,ESLD合并IFI的诊断方式多样且各有优势,但目前该类患者仍存在严重的延迟诊断、延迟治疗等缺陷,且真菌感染不同于细菌感染,预防性使用抗真菌治疗仍存争议。有研究表明,有效抗真菌治疗的开始延迟时间1～2 d与死亡率上升有关[30]。此外,预防性使用抗真菌药物的时机尚未有明显的标准,大多数仍是经验性治疗,且存在抗真菌药物的肝脏毒性问题。在ESLD合并IFI的诊断中,需要进一步明确目前已有真菌检测方法的诊断效能,研发适合肝功能失代偿早期诊断效能的生物标志物是未来需要着重解决的临床研究方向。