表面增强拉曼光谱对黑色圆珠笔快速鉴别的检测研究

雷霏，王雅晨，孙其然，罗仪文，杨旭

（1.上海市公安局静安分局刑事科学技术研究所，上海 200070；2.司法鉴定科学研究院上海市司法鉴定专业技术服务平台司法部司法鉴定重点实验室，上海 200063）

自圆珠笔进入市场后，已逐渐成为人们使用较为广泛的书写工具之一。 目前，圆珠笔墨迹鉴定已成为文书鉴定工作中至关重要的一部分。 如何更加有效地分析和鉴别不同种类的圆珠笔油墨，是目前研究的一个难点。 圆珠笔油墨主要由溶剂、着色剂、树脂和助剂四个部分组成[1]。常见的圆珠笔墨迹检测和鉴别方法包括紫外可见光谱法[2]、高效液相色谱法[3]和质谱法[4-5]等。 拉曼光谱作为一种分子振动光谱，因其具有无损、快速定性等优点，一直受到业内学者们的广泛关注。 而拉曼光谱主要用于对圆珠笔油墨中的着色剂进行检测分析[6-9]。 传统的拉曼光谱由于易受荧光干扰，信号强度和灵敏度均较低，在实际检测中谱峰信号差异不显著，致使鉴别难度较大。

近年来，表面增强拉曼光谱（surface enhanced Raman spectrometry，SERS）因其较高的灵敏度和通用性得到广泛关注[10-11]。 2009 年，IRINA 等[12]选取了甲基紫罗兰、苏丹黑B、帕拉罗沙宁等10 种具有代表性的有机染料，分别对其粉末和溶液进行了常规拉曼检测和表面增强拉曼检测。 结果表明，由于在常规拉曼光谱中受到荧光干扰而没有检测到拉曼信号的染料分子，却在增强后能够得到明显的特征峰谱图。 基于此，表面增强拉曼开始替代常规拉曼技术，在各个领域崭露头角。 但在目前的文献报道中，除了ALYAMI 等[13]、RAZA 等[14-15]研究了不同的纳米颗粒制备方法对圆珠笔墨迹的检测效果外，缺乏针对墨迹鉴定的应用研究。 而在实际案件中，不同种类的圆珠笔油墨的区分往往是侦破案件的关键，如何快速区分不同品牌和不同类型的圆珠笔油墨值得行业研究人员关注和研究。

本文以黑色圆珠笔为研究对象，选取了目前国内市场上55 种不同品牌的黑色圆珠笔，在785、633、514 nm 3 种不同激发光波长下，用自制纳米银胶体溶液对样品进行表面增强拉曼检测，比较了样品在增强前后的特征峰信息，并将3 种激发光波长下的样品数据相结合，以实现在快速检验的基础上，更加可靠地区分不同品牌的圆珠笔油墨。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

InVia 型激光显微拉曼光谱仪（英国雷尼绍公司）；S-4800 型场发射扫描电镜（日本日立公司）。

纳米银溶液的制备：用于SERS 探针的纳米银胶体是在LEE 等[16]研究方法基础上改进而合成的。首先，将9 mg 硝酸银溶解在50 mL 去离子水中，加热至沸腾，将4 mL 质量分数为1%的柠檬酸钠水溶液逐滴缓慢地滴加到沸腾的硝酸银溶液中。 然后，持续加热20 min，将制备好的灰绿色胶体银溶液冷却至室温，再以5 000 r/s 的转速离心10 min，取上清液，用水清洗2～3 次。 最后，去除97%的上清液，沉淀物用少量水稀释后置于5 ℃的黑暗环境中，密封保存待用。

55 种不同品牌的黑色圆珠笔样品信息如表1所示；80 g A4 复印纸（亿王纸业有限公司）；结晶紫、甲基紫2B、碱性蓝7 标准品（国药集团）；柠檬酸钠（美国Sigma-Aldrich 公司）为分析纯；硝酸银（SinoPharma 公司）为分析纯；乙醇（阿拉丁公司）为分析纯；实验用水为经Milli-Q 纯水仪纯化后的纯水。

表1 55 种不同品牌的黑色圆珠笔样品信息

1.2 仪器条件

扫描电镜条件 放大倍率为250、500、1 000倍。

拉曼光谱仪条件 扫描范围为300～2 000 cm-1；激发光波长为785、633、514nm；光谱分辨率为2cm-1。

1.3 方法

样品的制备：分别使用表1 中黑色圆珠笔执直尺于空白纸张（2 cm×6 cm）上先划一条横线，然后划两条与横线垂直交汇的竖线，将写好的纸张用双面胶粘贴于载玻片上待用。

扫描电镜检测：将制备好的纳米银胶体放入80℃烘箱中烘干后，取少量粉末分散在导电胶上用于扫描电镜的检测。

拉曼检测：用直径为0.3 mm 的玻璃毛细管沾取纳米银胶体，再让其自然吸附到纸张表面（使纳米颗粒均匀密集的分布在待测的墨水线上，而不会大面积的洇散，增强的位置选择在两条墨水线的交汇处），开始检测，每个样品平行检测3 次，以获得最佳光谱结果。

2 结果与讨论

2.1 纳米银的制备与表征

图1 显示了制备的纳米银颗粒的扫描电子显微镜（scanning electron microscope，SEM）图像，可以看出，所制备的纳米银颗粒呈尺寸较均匀的球形，粒径大约为40～50 nm，符合李东[17]所提出的能够获得最佳增强效果的纳米银颗粒表征。

图1 纳米银颗粒的SEM 图像

为了验证自制纳米银的表面增强效果，在785 nm激发光波长下，分别检测样品22 在增强前后的拉曼光谱信息，增强效果明显，如图2 所示，其中，NRS表示增强前光谱，SERS 表示增强后光谱。

图2 样品22 在785 nm 激发光波长下的增强前光谱和增强后光谱对比

2.2 不同激发光波长下的表面增强拉曼光谱

图3 选择了样品47和样品50两个样品的谱图作为两组圆珠笔的代表，比较其在785、633、514 nm这3种激发光波长下增强前后的拉曼光谱。在785nm激发光波长下[图3（a）]，可以看出增强前两个样品之间没有显著差异，而增强后，两个样品的拉曼信号显著增强，在420、520、725、840、860、915、1 180、1 260、1 320、1 365、1 440、1 585、1 620 cm-1处的特征峰信号都有明显提高，谱图显示其墨迹中含有结晶紫、甲基紫2B类染料。47号样品在1 320 cm-1处的特征峰显示出微弱的红移。在633 nm激发光波长下[图3（b）]，增强前样品的拉曼信号非常差，仅仅在420、1 180、1320、1365、1620cm-1处出现微弱的特征峰。 而增强后的特征峰信号明显增强。 在514 nm激发光波长下[图3（c）]，样品在增强前就有较好的拉曼信号。 值得注意的是，样品47在1 710 cm-1处出现特征峰信号，这在785、633nm激发光波长下均未出现。

图3 样品47 和样品50 在785、633、514 nm 激发光波长下增强前光谱和增强后光谱对比

2.3 分类与识别

为了能够更加准确地对圆珠笔进行分类与定性，首先检测了结晶紫、甲基紫2B 和碱性蓝7 这3种常见圆珠笔染料标准品的表面增强拉曼光谱，表2 展示了3 种常见圆珠笔染料标准品在不同激发光波长下的标志性特征峰信息。

表2 3 种常见圆珠笔染料标准品的标志性特征峰

图4 展示了在785nm激发光波长下，同一品牌（三菱）的不同型号的样品10和样品53在增强前后的谱图。 由此可以看出，在NRS谱图中未能体现出特征峰差异（500～600cm-1区域），而在SERS谱图中却能很好的得到体现。 这说明SERS不仅可对不同品牌的样品进行区分，还能对同一品牌不同型号的样品进行区分。

图4 同一品牌不同型号的样品10 和样品53 的增强前光谱和增强后光谱对比

图5 显示了在785、633、514 nm 3 种激发光波长下增强后的55 个样品分类示例，因为样品数量较多，每种谱图均选取几个具有代表性的样品展示。 在785nm激发光波长下，可以将样品分为5组。 样品18代表的是第1 组，其代表性峰主要集中在1 200～1500cm-1区域，三个主峰位于约1 240、1 285、1 360 cm-1处。第1 组与其他4 组的差异最为明显，由于其在420、1 160、1585、1620cm-1等处均没有出现明显的特征峰信号，而这些特征峰都是结晶紫、甲基紫2B和碱性蓝7的标志性特征峰，因此可以推断第1 组样品中不含上述成分，其他4 组的光谱信息显示出更多的相似性。 在420、920、1 160、1 585、1620 cm-1等位置的特征峰与甲基紫2B 和结晶紫的特征峰位置相吻合。在第4 组1300～1400cm-1区域、第5 组500～600 cm-1区域，存在实际差异性特征峰。在633nm 激发光波长下，增强后的样品谱图可分为3 组。区分率较低可能有两种原因：（1）由于结晶紫和甲基紫2B 的响应较强，样品中存在的其他染料成分的信号被覆盖，这可能导致用于区分样品种类的成分信息没有在SERS 光谱中表现出来；（2）相比于785nm 的激发光波长，633 nm 激发光波长对圆珠笔油墨信号的响应较差，检测到的样品谱图信息不够完整。 在514nm激发光波长下，样品同样可分成3组，第1 组、第2 组都在1650cm-1处有一个特征峰， 这是其他组样品所没有的，而第1 组在1 650 cm-1处特征峰的相对强度要明显低于第2 组，与此同时，在第2 组中还发现了位于605cm-1和1 510 cm-1处的差异性特征峰。

图5 785、633、514 nm 这3 种激发光波长下的SERS 光谱分组情况

表3 列出了785、633、514 nm 3种激发光波长下的SERS谱图的分组情况及其差异性特征峰信息。其中785 nm激发光波长下的区分率最高，能将样品分成5 组，这可能是因为785nm 激发光波长下的SERS效果最好，能够检测到更多的特征峰信息（图6）；633 nm激发光波长展现出了样品48的差异性，可以将其与样品50 归为一类，样品18 和样品28 这2 种特殊的成分能够明显与其他圆珠笔样品区分开来，这与785 nm 激发光波长检测信息相吻合；而根据在514 nm 激发光波长下测得的SERS 谱图信息，样品47、样品48 也检测到与样品18、样品28 相似的差异性特征，这为种类区分提供了新的线索。

表3 785、633、514 nm这3种激发光波长下的样品分组信息

表4 将785、633、514 nm 3 种激发光波长下的SERS 谱图所有的分组数据结合在一起，得到了更为全面的分组信息，可以将样品细分成8 组。

表4 样品汇总分组信息

结果发现，在增强前，不同样品的特征峰信号在强度上有很大差异。 一些样品具有较强的信号，可以检测到明显的特征峰信息，而一些样品由于本身信号较弱或者受到较强的荧光干扰，导致无法检测出拉曼特征峰，因此增强前的样本区分通常取决于拉曼信号的有无。 然而，在整体样本信号较弱的情况下，这种区分方式的可靠性不高。 对于没有特征峰信号或信号极弱的样品， 可能会因为缺乏部分关键信息而错误的将其归为一类， 导致样品分类出现偏差。SERS 谱图的分类是依据特征峰位置和相对强度的差异，这些信息可表明不同样品在成分和含量上的区别，从而有效对其进行分组。 在此基础上将785、633、514 nm 3 种激发光波长下获得的样品分组信息相结合，可以获取更加可靠的分组信息。

3 结论

本研究通过比较SERS 光谱与常规拉曼光谱，发现未增强的拉曼谱图不足以为圆珠笔的种类区分提供充分信息，甚至无法对某些样品进行定性，而SERS 谱图可为区分圆珠笔油墨成分提供更多有效信息。 本研究比较了785、633、514 nm 3 种激发光波长下所获得的光谱信息，发现785 nm 激发光波长下的区分率最高；而将这3 种激发光波长下的谱图信息相结合，可获取更加全面的区分数据，使分组信息的可靠性大幅提高。 本研究方法通过对黑色圆珠笔墨迹快速、原位的表面增强拉曼光谱进行定性分析，为司法鉴定领域中书写材料的快速检测和分类提供了更多的思路。