移液吸头微萃取技术在法医毒物分析中的应用

阳硕，相佳宏，李子怡，许琳灏，施妍，刘伟

（1.司法鉴定科学研究院上海市法医学重点实验室上海市司法鉴定专业技术服务平台司法部司法鉴定重点实验室，上海 200063； 2.中国药科大学药学院，江苏南京 210009）

样品前处理是法医毒物分析中一个重要的环节，尤其是体内毒物分析，生物检材基质复杂、目标物含量极低且存在形式多样，在复杂的生物基质中对痕量目标物进行提取、纯化和浓缩直接关系到分析数据的准确性和结果判断的科学性。 因此，高效且环保的样品前处理方法对于分析结果的判断显得至关重要。

常见的样品前处理方法主要有固相萃取、液液萃取、蛋白沉淀法、微透析技术、超临界流体萃取等。 固相萃取因其试剂用量少，且可与分析仪器在线连接，从而提高检测效率，已被广泛应用于复杂基质的提取富集，但缺点是耗时长、成本高以及重复性难以保证。 液液萃取也被广泛应用于法医毒物分析领域，如菊酯类农药、苯二氮类镇静安眠药、苯丙胺类毒品等[1]。 与固相萃取相比，液液萃取操作简便、无特殊设备要求，但该样品前处理方法中的混合液易形成乳化现象，且萃取剂通常为有毒有机溶剂，可能存在污染环境的问题。 除了上述提到的固相萃取和液液萃取外，还有许多其他的样品前处理方式，如简单快捷的蛋白沉淀法，可进行活体取样的微透析技术以及相对环保的超临界流体萃取技术等。 但是这些方法均存在不足，如蛋白沉淀法不能完全去除内源性物质，会稀释样品浓度，同时还存在生物样本对环境造成污染的问题。 微透析技术虽然可以活体取样，且所需样本量较小，但是会对局部组织造成损伤，适用范围较窄，只适用于水溶性、小分子物质，对法医毒物分析领域的大多数目标物并不适用。 超临界流体萃取技术可提取植物内的生物活性物质，但提取过程中使用的夹带剂会残留在组分中，由于对反应釜的要求很高，前期投入较大，故该方法多应用于工业提取。

相较于上述提及的多种样品前处理方法，移液吸头微萃取技术在法医毒物分析中有着巨大优势。该方法所需样本量小、提取速度快、回收率高、选择性好，并且消耗的有机溶剂少，更加环保，适用于法医毒物分析中的多种检材和目标化合物。 移液吸头微萃取技术属于微固相萃取（μ-solid phase extraction，μ-SPE），其在传统固相萃取的基础上进行改善和发展，已应用于诸多法医毒物分析实例中。本文将系统性地介绍移液吸头微萃取技术及其在法医毒物分析中的应用。

1 前处理方法概述

固相萃取（solid phase extraction，SPE）可分为传统的固相萃取、固相微萃取（solid phase micro-extraction，SPME）、μ-SPE 和磁固相萃取（magnetic solid phase extraction，MSPE）。本文介绍的移液吸头微萃取技术属于μ-SPE，而μ-SPE 又可分为以下三类：移液吸头固相萃取（μ-solid phase extraction pipette tips，μ-SPE-PT）、分散式移液吸头微萃取（disposable pipette extraction，DPX）、吸附剂填充式微萃取（micro-extraction by packed sorbent，MEPS）。本文所介绍的移液吸头微萃取是指μ-SPE-PT（1989 年提出的）[2]和DPX（2003 年提出的）[3]。

移液吸头微萃取技术适用于多种生物样本的检测分析，检测效率高[4]。 移液吸头微萃取技术是目前基因组学、蛋白质组学和代谢组学中纯化、浓缩和选择性分离蛋白质和多肽的重要工具[5-7]。 相比于传统的固相萃取，移液吸头微萃取所需要的样品量小，消耗的有毒溶剂也更少，还可以重复使用，从而提高回收率[8]。 因此，该萃取技术不仅操作简单，而且提取效率也更高。 对于生物样品，尤其是样本量较小的生物样品，移液吸头微萃取的效果要远优于传统的固相萃取[9]。 萃取移液吸头有商业版本和自制版本，自制移液吸头大多应用于精神类药物和污染物的萃取，可重复使用，减少了生物样品带来的环境污染和潜在传染性，另外也可在实验室进行一些预实验，为其商业化提供建议和方向。 由于自制移液吸头费时费力，因此在常规实践中优先选择商业版本的移液吸头。 移液吸头微萃取是一种发展中的新技术，相比于其他前处理方式的成本更高，这也是其应用受限的主要因素。

1.1 μ-SPE-PT

μ-SPE-PT 是传统固相萃取的小型化版本（具体可参考文献[10]），其移液吸头头部有特殊的形状，可以将吸附剂包裹其中，达到固定吸附剂的目的，移液吸头体通常由聚乙烯、聚丙烯、聚四氟乙烯或聚烯烃制成[11]。 相比于传统的SPE，μ-SPE-PT 的样品萃取速度更快，且回收率也更高[12]。

μ-SPE-PT 的应用方法简单：首先，选用合适的溶剂激活吸附剂。 吸附剂位点活化后使该固相和样品中的分析物之间产生适当的分子作用，然后使样品溶液进入移液吸头，吸附剂（固相）可以吸附样品中目标化合物和干扰化合物，随后使用有机溶剂或混合溶剂来去除干扰物。最后，用一种溶剂洗脱目标化合物[10]。 使用时应注意移液吸头堵塞和针管污染的问题，因此，样品在使用移液吸头提取前有必要对样品进行简单的预处理，且吸取样品时应该小心谨慎，以防止污染。

1.2 DPX

DPX 由传统的SPE 改造而来，是固相萃取和分散萃取的结合。 DPX 萃取装置有1 mL 或5 mL 两种容量的移液吸头，最初粉状吸附剂自由地分散在移液吸头内，后来对装置进行改进，吸附剂可以很好地分散在两个固定装置之间，处于装置下端较低的部分（具体可参考文献[10]），有利于液体的双向流动，同时还可防止注射器被污染。

DPX 的使用步骤大致与μ-SPE-PT 相类似，但原理有一些不同。 首先，用溶剂来活化吸附剂，然后将样品吸入移液吸头并与吸附剂充分混合，最后用合适的洗脱剂洗脱杂质。 如果所需组分的回收率较低， 则可通过重复整个过程的步骤来提高效率，包括重复样品上样和样品洗脱。 与μ-SPE-PT 不同的是，在提取过程中可吸入少许空气，使样品溶液中的目标物和吸附剂充分接触、混合，从而提高样品回收率[13]。 DPX 前处理过程简单，只需要在上样前对样品进行简单的预处理（如稀释、离心、蛋白沉淀等）即可，以防止萃取移液吸头发生堵塞[14]。

2 移液吸头微萃取技术在法医毒物分析中的应用

DPX 和μ-SPE-PT 是常见的两种微萃取移液吸头，市面上有许多商业化的微萃取移液吸头，对于不同性质的目标物，其对应的吸附剂也有所不同。 在法医毒物分析领域，目前已报道的商业萃取移液吸头的吸附剂有：苯乙烯-二乙烯苯（SDVB）、磺酸官能化的阳离子交换剂（CX）、十八烷基硅烷颗粒（C18）、反向吸附剂-盐析（RP-S）、弱阴离子交换剂-盐析（WAX-S）、强阳离子交换剂（SCX）等。除了商用吸附剂，许多实验室也会通过自制吸附剂来达到检测目的。 已报道的有关法医毒物分析的自制萃取移液吸头吸附剂有：聚丙烯腈和金属有机骨架组成的纳米纤维（PAN/MIL-53（Fe））、微碳纳米管（MWCNT）、胺功能化锆基金属有机框架（Zr-MOFNH2）、苯乙烯-二乙烯苯共聚物（SDVB copolymer/PANI composites）、十八烷基硅烷外表面包有牛血清白蛋白（RAM-C18-BSA）、三维-离子液体-Fe3O4-石墨烯纳米复合吸附剂（3D-IL-Fe3O4-GO）、聚甲基丙烯酸-乙二醇二甲基丙烯酸酯[poly（MMA-co-EDMA）]等。 已有很多研究[15-42]报道过移液吸头微萃取在法医毒物分析领域中的应用，具体如表1 所示。

表1 移液吸头微萃取在法医毒物分析中的应用

2.1 移液吸头微萃取技术在毒品分析中的应用

2.1.1 大麻类

大麻是全球范围内滥用最为严重的毒品[15]。Δ9-四氢大麻酚（Δ9-THC）是大麻中的主要活性成分，而Δ9-四氢大麻酸（Δ9-THC-COOH）是其主要代谢产物，因此Δ9-THC-COOH 是尿液中的主要检测目标物，Δ9-THC 是血液及口腔液中的主要检测目标物。口服Δ9-THC 的生物利用度低，仅有4%～20%，口服后4～6 h 的血药峰质量浓度通常不超过10 ng/mL[43]，如果近期有摄入过大麻，在呼气中也可检出Δ9-THC，质量浓度通常比血液中的更低（pg/mL）[44]。 因此，需要建立一种更加快速灵敏且高效的检测分析方法。目前，已报道的检测血液中Δ9-THC 含量的前处理方法有SPE[45-46]和LLE[47-49]等。 但前处理时间较长，不利于半衰期短且生物利用度低的Δ9-THC 在生物基质中的检测分析，且重复性也难以保证，而快捷的移液吸头微萃取能够缩短前处理时间且具有较高的重复性，弥补了SPE、LLE 等存在的缺陷。LUO 等[16]建立一种在血液和呼气中应用新型衍生化法检测大麻酚（CBN）、大麻二酚（CBD）、四氢大麻酚（THC）及其代谢物的方法，将200 μL 血液及呼气样品加入内标后，重氮衍生化0.5 h，衍生化后的呼气样品直接进入LC-MS/MS 系统分析，血液样品应用商业的DPX 萃取移液吸头和WAX-S 吸附剂，并利用衍生化反应显著提升了在血液中检测CBN、CBD 等的灵敏度，血液和呼气中目标物定量限分别低至0.1～0.25 ng/mL 和0.5～2.5 pg/mL，较以往的在呼气中检测THC 的方法灵敏度提高了约100 倍[44，50-51]。

已报道的应用移液吸头微萃取技术在生物基质中检测分析大麻类的方法中（表1），均使用内标进行校正其轻微的基质抑制作用[23]。 大多数前处理方式为乙腈沉淀蛋白后使用DPX 萃取移液吸头和弱阴离子交换剂-盐析（WAX-S）吸附剂进行提取。由于THC 及其代谢物为弱酸性化合物， 因此选择弱阴离子交换剂进行吸附。 目标物均为类脂溶性化合物，难溶于水，盐析可以辅助目标物从水相转移到有机相，从而进一步提高回收率。 另外，杂质会保存在吸附剂上，故不需清洗和洗脱步骤，方便快捷。

2.1.2 苯丙胺类

甲基苯丙胺是一种强效的中枢神经兴奋剂。 在已报道的生物基质中检测苯丙胺类毒品的方法中，大多数前处理方式为SPE[52-54]或LLE[55-58]等，但是通常需要的前处理时间较长，且会消耗大量的有机溶剂，容易造成环境污染。 KUMAZAWA 等分别应用μ-SPE-PT 萃取移液吸头和C18吸附剂提取血液[22]和尿液[25]中的甲基苯丙胺和苯丙胺。在100 μL 的血液中加入400 μL 水和50 μL 5 mol/L 氢氧化钠溶液，然后经过25 次移液吸头萃取循环，将吸附剂与目标化合物充分混合后用甲醇洗脱，洗脱5 次后用三氟乙酸酐进行衍生化，最后使用GC-MS 进行分析检测。其中，甲基苯丙胺的回收率大于87.6%，苯丙胺的回收率大于81.7%，检出限分别为1.5、1.1ng/mL。尿液的体积为500 μL，前处理步骤和血液一致，最后使用GC-MS 进行检测分析，甲基苯丙胺的回收率大于82.9%，苯丙胺的回收率大于82.2%，检出限分别为0.08、0.1 ng/mL。 与其他检测方法相比（表1），KUMAZAWA 等[22]和MONTESANO 等[23]所提的方法中，移液吸头提取循环次数最多（25 次），回收率也较高（79.7%～94.7%），侧面反映出循环次数的增加有利于提高目标物的回收率，但要注意吸附剂饱和现象[23]。

2.1.3 其他毒品

除了上述提到的大麻类和苯丙胺类毒品，也有应用移液吸头微萃取技术对其他毒品进行提取纯化的报道。 STOWE 等[59]提出一种在头发基质中检测阿片类物质的方法，该方法的前处理过程应用了DPX 萃取移液吸头和CX 吸附剂。 首先，将12 mg头发置于1.1 mL 甲醇和三氟乙酸（体积比为90∶10）溶液中，微波炉中90 ℃加热60 min，使用含有吸附剂的萃取剂移液吸头提取后用600 μL 0.1 mol/L 的乙酸盐缓冲溶液冲洗两次，甲醇溶液冲洗一次，以去除杂质干扰。 再使用550 μL 二氯甲烷-异丙醇-氢氧化铵（体积比为80∶20∶3）溶液洗脱，40 ℃下氮气吹干洗脱液，最后用225 μL 0.1%（体积分数）甲酸水溶液复溶。 该前处理方法结合LC-MS 技术对头发中可待因、吗啡、羟考酮等阿片类物质进行检测分析，回收率为54%～81%，定量限为0.05 ng/mg。此外，由于阿片类药物在C18吸附剂上的保留较差，故在检测目标物含有阿片类物质时，微萃取移液吸头的吸附剂通常不选择C18吸附剂。

2.2 移液吸头微萃取技术在精神类药物分析中的应用

精神药物主要有抗抑郁药、抗精神病药、抗惊厥药和其他相关药物，主要目的是治疗各种精神疾病。 近年来，精神药物的滥用也在增加[60]，对公共安全造成了一定威胁。 KUMAZAWA 等[35]提出一种在100 μL 血浆中检测分析五种酚噻嗪类物质的方法，该方法应用μ-SPE-PT 萃取移液吸头和C18吸附剂进行前处理提取（循环25 次），然后使用200μL10%甲醇溶液清洗杂质，清洗后的移液吸头放置在真空下干燥30 s，干燥后用100 μL 甲醇洗脱5 min，洗脱液直接注入GC-MS 进行检测分析，目标物回收率为91%～95%，定量限为2.5～20 ng/mL。 该提取方法的洗脱液直接注入气相色谱仪，无需挥干复溶，步骤简单快捷，相比与常规的固相萃取，时间缩短了至少15 min，另外消耗的样品仅100 μL，溶剂总共消耗0.7 mL，均比之前的报道更少，有利于减少环境污染。 该方法为法医毒物分析中酚噻嗪类药物的筛选和定量分析提供了新的思路和工具， 有望引入常规检测，更加广泛的应用。

3 结语与展望

在法医毒物分析中，移液吸头微萃取技术作为一种在传统固相萃取基础上发展而来的先进技术，适用于各种生物样品的前处理，其应用前景十分可观。 相比于传统固相萃取，移液吸头微萃取技术具有提取效率高、环保、所需样品量少、可重复使用和可自动化等优点，虽然也有价格昂贵、商业化产品数量少和吸附剂会发生饱和等不足之处，但发展前景依然十分可观，有望进一步降低成本，扩大生产，争取尽早在常规检测中广泛应用。