AFS-9700型原子荧光光度计测定尿中砷的研究

许可清 闽侯县疾病预防控制中心 （福建 福州 350100）

内容提要： 目的：利用AFS-9700型原子荧光光度计建立尿中砷的测定方法。方法：尿样经硫酸、硝酸、过氧化氢处理后，将硫脲、盐酸和抗坏血酸试剂直接加入10mL具塞刻度消化管内定容后，上机测定。调整仪器条件为最佳的情况下，分析研究测定中盐酸和硼氢化钾的最适浓度、样品前处理、加标回收率、精密度及检出限等，并对比该方法与WS/T 474-2015《尿中砷的测定氢化物发生原子荧光法》的结果。结果：该文建立的测定方法中，尿砷处于0～100μg/L的含量范围时，荧光强度与砷浓度间有线性关系，检出限0.07μg/L、加标回收率95%～105%、相关系数不低于0.9995，相对标准偏差低于10%。相比标准方法而言，P＞0.05，两者差异无统计学意义。结论：该文建立的方法相比标准方法而言，弥补了前处理中过多取样量、使用器材复杂、酸用量多、操作繁琐等缺点，且操作简便、检出限低、线性范围宽、基体干扰少，在低、中、高及大批量尿中砷测定中适用，可行性与应用价值可观。

砷是一种广泛存在于自然界中的元素，它可以以多种形式存在于环境中，并与许多生物和无机物质相互作用。砷的存在对人类健康构成了潜在的威胁，因为它被认为是一种致癌物质。尿液中的砷含量是评估个体砷暴露水平的重要指标之一[1]。目前，砷斑法、催化极谱法、原子吸收法、分光光度法、HPLC与HG-AFS联用技术等都适用于尿砷的检测，其中原子荧光光度计已经成为测定尿液中微量元素含量的常用方法之一[2]。AFS-9700型原子荧光光度计是一种高灵敏度和高精确度的仪器，广泛应用于环境监测、食品安全和医学检验等领域[3]。本文利用AFS-9700型原子荧光光度计来测定尿液中砷的含量，探索经济、简便、准确、快速且具备较强适用性的分析方法，为环境监测、食品安全和医学检验等领域提供科学依据和技术支持[4]。同时，希望能够进一步了解尿液中砷的来源、分布规律以及与人体健康之间的关系，为预防和控制相关疾病提供参考依据。

1.材料与方法

1.1 一般材料

研究起止时间：2022年6月～2023年6月。

仪器：AFS-9700 原子荧光光度计（北京海光仪器公司）；AED-IV多孔（60孔）自控电热消化器（北京博瑞赛科技有限责任公司）；砷空心阴极灯及配套分析软件（北京瑞利分析仪器公司）；1%电子天平（北京赛多利斯科学仪器有限公司）；10.0mL（15mm×140mm）具塞刻度消化管。在进行试验前，所有使用到的玻璃器皿都经过了处理，先被浸泡在20%硝酸中一整夜，然后用去离子水进行冲洗，以确保干净无杂质。

试剂：96%硫酸（国药集团化学试剂有限公司）、5%、18%盐酸（重庆川东化工有限公司），66%硝酸（国药集团化学试剂有限公司）、30%过氧化氢（东莞市乔科化学有限公司），均为优级纯；内含0.5%氢氧化钠（上海山海工学团实验二厂，优级纯）的2%硼氢化钾（国药集团化学试剂有限公司）、10%抗坏血酸（上海四赫维化工有限公司）与10%硫脲（国药集团化学试剂有限公司）混合溶液，均为分析纯；砷标准应用液（国家标准物质中心），ρ（As）=1.0μg/mL：吸取ρ（As）=1 000.0μg/L的砷标准液，逐级配制为应用液，浓度1.0μg/mL；试验采用正常人尿液混合成的尿液样本；载气为氩气，纯度＞99.99%；试验用水为超纯水，比电阻≥18.2MΩ·cm·25°C。

1.2 方法

1.2.1 仪器工作条件

光电倍增管负高压280 PMT（V）；原子仪器高度8mm；灯电流50mA；气压0.2MPa；辅阴极电流25mA；屏蔽气流量900mL/min；截气流量400mL/min。

1.2.2 试验原理

在对尿样进行湿法消化处理之后，为将尿样中的五价砷还原为三价砷，可在酸性介质中添加硫脲和抗坏血酸混合液。使用硼氢化钾作为还原剂，得到砷化氢[5]。通过添加氩气，砷化氢会与氩气一起进入石英原子化器，砷化氢经过分解后转变为原子态砷。原子态砷经砷空心阴极灯发射光照射后会发出特定的光谱信号，在固定的条件下，被测液中砷浓度与原子荧光强度间呈正比关系[6]。同时，采用标准系列展开对比。

1.2.3 样品前处理

在具塞刻度消化管（10.0mL）内装入尿样（1.0mL），添加30%过氧化氢0.5mL、66%硝酸0.3mL、96%硫酸0.2mL，置于AED-IV自控电热消化器，200°C条件下持续50min消化处理，得到呈无色或淡黄色的0.2mL溶液，若有棕黄色烟或溶液颜色偏深，表明有较多杂质，需取出冷却后添入过氧化氢0.5mL并加热分解，直至管壁内无回流现象，当消化管内的白色或黄色气体消失，并且原本有颜色的液体经过反应而变得无色透明，表示消化已经完成[7]。为了确保试验结果的准确性和可靠性，在进行消化试验时制作3个空白试验。

1.2.4 试验方法

稳定性试验：取42份尿样，分别添加砷标准应用溶液，加标定容至10.0μg/L。选择其中6份展开测定，余下样品保存至4°C下环境内，后续每间隔2d选择6份进行测定。

标准曲线与线性范围：取6支具塞刻度消化管，每支容量10.0mL，分别加入浓度为1.0μg/mL、体积不同的砷标准工作液（0.00、0.10、0.30、0.50、0.70、1.00mL）后，添加正常人混合尿溶液1.0mL、30%过氧化氢0.5mL、96%硫酸0.2mL、66%硝酸0.3mL，摇匀后置于AED-IV自控电热消化仪上，200°C条件下持续50min消化处理，处理后的溶液呈淡黄色或无色，体积0.2mL；冷却后，分别加入18%盐酸1.0mL、10%抗坏血酸和10%硫脲混合溶液1.0mL，并选择超纯水定容至10.0mL，制成一系列不同浓度的砷标准溶液（0.0、10.0、30.0、50.0、70.0和100.0μg/L），混匀、静置20～min，上机测定。

检出限：以上文1.2.1仪器工作条件为参照，重复11次对恒定含量的10.0μg/L标准液展开评价测定。

精密度：配制三种不同浓度的砷标准溶液，分别为10.0μg/L、50.0μg/L和100.0μg/L。重复测定每种浓度溶液11次，计算相对标准偏差（RSD）。选择同一尿样，采用本文建立的方法与标准方法平行测定6次，对两种方法测定同一尿样进行对比分析。

准确度：选择的样本为正常人混合尿液，向样品中添加不同浓度的砷标准溶液进行测定。对试验结果进行观察和分析。

1.3 观察指标与判定标准

分析研究测定中盐酸和硼氢化钾的最适浓度、样品前处理、加标回收率、精密度及检出限等，并对比该方法与WS/T 474-2015《尿中砷的测定氢化物发生原子荧光法》的结果。

1.4 统计学分析

选择Excel 2010软件作为数据录入的工具，采用SPSS 17.0软件进行数据处理和统计分析。

2.结果

2.1 稳定性试验

根据1.2.4试验结果显示，在2周时间范围内，能够较好地保存样品。

2.2 标准曲线与线性范围

确定纵坐标为荧光强度If、横坐标为砷浓度C，线性回归，得到If=79.192×C+100.843 的线性方程，相关系数为0.9999。

2.3 检出限

经计算得到1.96%的标准偏差RSD，参考3倍标准偏差除以斜率，检出限为0.07μg/L。

2.4 精密度

结果显示，10.0μg/L溶液的RSD为1.96%，50.0μg/L溶液的RSD为3.97%，100.0μg/L溶液的RSD为2.73%，皆与《研制生物样品检测检验方法指南》（WS/T 68-1996）等相关要求相符合。采用本文建立的方法与标准方法平行测定6次，得到表1所示结果。

表1.两种方法测定同一尿样的对比分析(μg/L)

从表1中可以看出，两种方法所测值均处于标准差偏差允许范围，10%的相对标准偏差进一步表明方法精密度较高。对比两种方法的相对标准偏差。结果显示，本文建立方法为2.8%，而标准方法为4.9%，前者精密度、稳定性更高。采取Grubbs检验和F双边检验，结果显示两组数据均无异常值，并且在精密度方面的差异在统计学上没有意义。采取t检验来比较两种方法的测定结果。计算得到的统计量t=0.353，在给定α=0.05和自由度f=10的情况下，查表得到t0.05（10）=2.228。由于t＜0.05（10），说明本文建立方法测定结果与标准方法测定结果没有显著性差异。

2.5 准确度

通过对试验结果进行观察和分析发现，测定结果的回收率在95.0%～105.0%，测定值未超出标准偏差范围，表明所采用的方法具有较高的精确性和稳定性，在实际应用中可以得到可靠的结果。同时，试验结果符合《职业卫生标准制定指南第5部分：生物材料中化学物质的测定方法》（GBZ/T 210.5-2008）的要求。表2列出试验相关数据情况。

表2.准确度试验(μg/L)

3.讨论

3.1 消化仪及消化管的选择

砷属于易挥发元素，处于消解中的尿液样品所面临的干扰因素诸多，如硝酸根残留、消解程度及温度等，同时还有尿液中的有机物和盐分[8]。因此，在检测过程中，样品的消化至关重要。采用具塞刻度消化管和AED-IV多孔（60孔）自控电热消化器[9]。在200°C的条件下，依照50min的时间消化处理尿样和标准系列，在F与t检验验证后发现，在统计学方面两种方法的差异并不显著，所测值没有超过不确定范围。

3.2 载流-盐酸度浓度的选择

在特定条件下，在2%～20%的范围内对载流盐酸浓度进行调整，同时观察相应的荧光强度变化[10]。通过试验观察发现，当盐酸为5%的体积分数时，荧光强度将达到最高点，此时也能达到最高的灵敏度。基于该观察结果，确定5%的盐酸体积分数。

3.3 硼氢化钾浓度的确定

在特定条件下进行试验后发现，硼氢化钾的浓度会在一定程度上影响测定结果。选择25.0μg/L内控样浓度的砷标准液作为比对，试验结果显示，在不同硼氢化钾溶液浓度下，荧光强度表现出不同程度的变化：30μg/L浓度时，能够达到最良好的荧光强度；浓度为20μg/L次之。在关注经济性的基础上，确定硼氢化钾溶液为20μg/L的浓度，即2%[11]。需要注意的是，由于该溶液稳定性不高，因此需要结合2g/L 0.2%氢氧化钾或5g/L 0.5%氢氧化钠进行溶解。

3.4 方法抗干扰分析

通过严格控制分析方法应用过程，能为试验数据提供可靠的质量保证。在相同条件下，直接在消化处理后的样品和标准系列中添加盐酸、硫脲和抗坏血酸试剂并定容，上机。样品空白值用“0”管测定，本底值扣除后，能消除样品消化、仪器及试剂等干扰。硫脲和抗坏血酸具有抗干扰的隐蔽剂作用，在一定程度上可以去除共存物的干扰，且尿样加标制备的标准曲线也能在一定程度上消除干扰[12]。所以，存在于尿样中的干扰原始基本上都不会对结果产生显著影响的水平。本文建立的方法，0～100.0μg/L范围内尿砷含量呈线性关系，达到不低于0.9995的相关系数，支持0.07μg/L的最低检测浓度，重复试验的相对标准偏差为2.8%（n=6）。尿样加标回收率在95.0%～105.0%，说明了该方法的准确性和可靠性。此外，经过试验验证，样品在4°C下至少可保存2周。这意味着该方法具有较高的稳定性，并且在实际应用中具有很强的实用性。尤其是针对高砷环境条件下的砷含量检测，该方法表现出了良好的稳定性和可行性。在试剂用量、取样量方面，本文建立的方法优于标准方法。在自控电热消化器AED-IV多孔（60孔）的作用下，结合具塞刻度消化管，试验操作更加简便，适用于处理大批量尿液中的砷含量测定。

综上所述，相比其他方法，本文建立的新方法具有许多优势。首先，该方法精密度高且灵敏度良好。通过试验数据分析，发现该方法在标准偏差方面较低。其次，该方法简便快捷，外界干扰较少，成本低且实用性强，线性范围宽，用于测定尿液中砷含量时简单易行。