重组胶原蛋白创面敷料关键性能及测试研究

王晓晨 夏文龙 杨政 柴谦*

1 山东省食品药品审评查验中心 （山东 济南 250014）

2 江苏海智生物医药有限公司 （江苏 南京 211500）

内容提要： 重组胶原蛋白基于基因优化修饰后的功能特点可制备成第二类重组胶原蛋白创面敷料医疗器械产品，广泛用于创面护理等生物组织工程领域。根据《重组胶原蛋白创面敷料注册审查指导原则》，结合技术审评经验和部分审评案例，从产品不可吸收方法选择和模型设计、物理阻隔层测试方法和效果评价、有效成分鉴别分析、有效成分含量测定的四方面梳理重组胶原蛋白创面敷料的关键性能指标，介绍目前常采用的检验方法，提供一些证明重组胶原蛋白创面敷料安全有效性能的设计方案，归纳分析不同鉴别含量测试方法的优势和缺点。以期为注册申请人提供申报参考，开拓研究思路，为统一各省技术审评人员对重组胶原蛋白创面敷料的审评标准和尺度提供帮助，促进第二类重组胶原蛋白创面敷料产品的高质量健康发展。

重组胶原蛋白是利用基因工程编辑技术，将含有人胶原特定类型基因编码序列（至少含螺旋域的全长或部分序列）、不同类型胶原蛋白基因编码的部分序列或人工设计的基因编码作为模板，经过拼装剪辑、优化组合等修饰过程重组表达得到的生物材料[1,2]。因能达到与动物组织提取的胶原蛋白相似的生物相容性和物理化学性能，重组胶原蛋白具有很强的亲水性及吸液性，可以吸收组织渗出物，并为表皮细胞的迁移、增殖铺垫支架[3]。基于编辑后的功能特点，重组胶原蛋白制备成液体、膏状、凝胶、纤维、海绵等型式的第二类医疗器械产品广泛用于创面护理、吸液止血、妇科黏膜修复等生物组织工程领域，尤其是重组胶原蛋白创面敷料可用于意外伤害、手术、溃疡等不同原因导致的真皮浅层及其以上的浅表性小创伤、擦伤，为创面愈合提供良好的营养基础，生物可降解性能更为突出，临床应用前景较传统敷料更具潜力。

山东省食品药品审评查验中心承担了国家药品监督管理局指导原则课题的研究工作，编制完成了《重组胶原蛋白创面敷料注册审查指导原则》[4]（以下简称导则），2023年5月国家药品监督管理局面向公众正式发布了该导则，明确了按第二类医疗器械管理的重组胶原蛋白创面敷料，产品中所含成分不具有药理学作用，不可被人体吸收，适用于非慢性创面及其周围皮肤的护理。导则对重组胶原蛋白创面敷料相关产品的技术审评、研发设计和注册申报具有一定的指导规范作用。目前，重组胶原蛋白创面敷料已成为众多医疗器械生产企业关注的热点产品之一，部分企业对重组胶原蛋白创面敷料的研发经验不足，对导则中要求的关键性能指标理解不到位或把握不准，找不到适用的检验方法，以至于在注册申报过程中进度缓慢或面临较大的困难。

本文以导则为主线，结合技术审评经验，汇总了导则中重组胶原蛋白创面敷料产品专属性较强的关键性能指标，对目前常采用的检验方法或设计方案展开对比分析，以期为医疗器械技术审评人员、医疗器械产品注册申报人员开阔思路、提供参考。

1.不可吸收试验

导则明确要求重组胶原蛋白创面敷料注册申报的非临床资料应提供产品不可被人体吸收的相关研究资料，如选择或设计可以模拟临床使用方式的试验，用以证明产品的安全性和有效性。

1.1 试验方式

目前国内外皮肤修复愈合研究多采用体外试验和体内试验两种方式对医疗器械产品有效性进行研究。体外试验通常以设计3D细胞模型试验为典型代表，能展现细胞培养的直观性和条件可控性，但试验结果与体内修复愈合效果之间缺乏相关性和说服力。体内试验则考虑到不同种属、品系的动物，甚至同一动物不同解剖部位的皮肤结构均不相同，皮肤通透性不同，根据急性、慢性和瘢痕性等不同研究类型构建不同的实验动物模型进行研究[5-7]。例如急性创伤修复模型具有创伤急、愈合快、有明确致病因素等特点，主要包括皮肤切线伤模型、皮肤切除伤模型、断层皮创面愈合模型、烧（烫）伤创面愈合模型等[8]。因此体内试验与临床预期用途创面有较好的一致性，更能贴合临床使用需求合理评价医疗器械产品的有效性。

1.2 动物模型构建

通常采用小鼠、大鼠、豚鼠、家兔、巴马香猪、恒河猴等动物制作的新鲜离体皮肤，模拟重组胶原蛋白创面敷料临床使用的非慢性创面，分别建立急性创伤修复模型开展体外试验研究[5-7]。出于动物权益保护的考虑，本方法为后续体外测试方法的建立和适用性，提供研究思路。

1.2.1 擦伤模型

家兔经麻醉剃毛、常规消毒后，取绑裹砂纸的小木棒，在背部脱毛部位用反复摩擦，制造的创面尽量控制在（长×宽）3cm×3cm以内，以红肿或轻微渗血为宜，剔除皮下脂肪及组织冲净备用[9]。

1.2.2 切割伤模型

巴马香猪经麻醉剃毛、常规消毒后，在背部脱毛部位用无菌针头或手术刀片划切，制备类似“井”字形（长×宽）3cm×3cm创面，以渗血为宜，剔除皮下脂肪及组织冲净备用[10-12]。新鲜离体巴马香猪创面模型见图1。

图1.新鲜离体巴马香猪创面模型

1.2.3 化学试剂灼伤模型

大鼠剪去背部的毛，用浸满8%硫化钠的纱布敷于大鼠背部皮肤5min，除去背部绒毛，以洁净纱布擦净皮肤表面残余硫化钠，剥取背部皮肤[13,14]。

1.3 透皮吸收试验结果

重组胶原蛋白的透皮吸收量，结合具体产品成分和配比，采用适宜方法，如可以选用高效液相色谱（或2，2'-联喹啉二羧酸（BCA）法）利用累积透过量方程进行计算。例如测定10min、20min、40min、80min、160min等，得到不同时间点的累积通过量，结果显示160min累积通过30.8%。建议结合产品临床预期用途和使用方法，考察一定时间内、质量浓度及透皮吸收剂对重组胶原蛋白透皮吸收性的影响[14]。

2.物理阻隔层测试

导则明确重组胶原蛋白创面敷料注册申报的非临床资料如宣称形成物理阻隔的保护层或具有成膜效果，应提供适用于申报产品的成膜性研究测试资料。

2.1 物理阻隔层的形式

重组胶原蛋白创面敷料因组成成分和配比不同，可以形成明显揭除的膜和不可揭除的膜两种形式的物理阻隔层，分别设计不同的试验验证医疗器械产品的有效性。

2.2 成膜可揭除的设计与评价

以包装于铝塑管的膏状重组胶原蛋白创面敷料为例，进行物理阻隔层评价。

示例（方法不限于此）：在（25±2）°C条件下，模拟临床使用方式，将重组胶原蛋白创面敷料从铝塑管中挤到消毒的创面表面（参考1.2的方法创建新鲜离体模型），用清洁指腹均匀涂抹，晾干尽量无大幅度动作活动，按固定使用量及涂抹面积进行记录成膜时间和流动状态，例如揭下来的膜应较完整且无肉眼可见的孔洞、涂抹后应无创面敷料向四周流淌等。用扫描电子显微镜，放大固定倍数观察膜的孔隙形貌特征。试验方法：取产品溶液倒入培养皿，控制厚度待干燥成膜。用扫描电子显微镜观察放大倍率400倍，可以观察膜的孔隙形貌特征（见图2）。

图2.重组胶原蛋白创面敷料成膜后扫描电子显微镜图（×400）

2.3 成膜不可揭除的设计与评价

以包装于聚乙烯推注器的液体重组胶原蛋白创面敷料为例，进行物理阻隔层评价。

示例（方法不限于此）：（25±2）°C条件下，分别在家兔背部2个擦伤处涂抹碘伏，选其中1处再将敷料3～5滴均匀涂布碘伏上，待敷料晾干。同时以另外1处不涂覆敷料仅涂碘伏的伤口作对照。用流动的水冲洗两处碘伏标记的伤口区域，对比两处的碘伏状态并记录。例如可观察到涂覆敷料处的碘伏在伤口保存完好，对照组碘伏冲洗殆尽等。

3.有效成分鉴别分析

导则明确重组胶原蛋白创面敷料注册申报的技术要求制定有效成分鉴别的性能指标，应结合产品实际情况，采用适宜的方法，以重组胶原蛋白为有效成分进行鉴别。

3.1 凝胶电泳法（SDS-PAGE）

性能指标示例描述（不限于此）为产品中重组胶原蛋白SDS-PAGE凝胶电泳图应在**KDa以上有条带；或是产品中重组胶原蛋白相对迁移率应与**对照品（需就对照品的选择提供合理性依据）相对迁移率一致，相对迁移率偏差应不得过**%。参考《中华人民共和国药典》（2020年版）[15]四部通则0541电泳法中第五法SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法（SDS-PAGE法）作为测试依据。

3.2 显色沉淀法

在重组胶原蛋白原材料按照YY/T1849-2022《重组胶原蛋白》[16]末端氨基酸序列法进行蛋白鉴别检测并提供检测报告，保证原材料质量可控的前提下，可采用显色沉淀法进行产品中重组胶原蛋白鉴别的测试。

性能指标示例描述（不限于此）为产品制成测试液加检验试剂，应产生橘黄色絮状沉淀、发生浑浊、有氨臭味实验现象。参考《中华人民共和国药典》[15]（2020年版）四部胶囊用明胶法作为测试依据。

3.3 傅里叶红外（IR）特征峰测定法

在重组胶原蛋白原材料按照YY/T1849-2022《重组胶原蛋白》[16]末端氨基酸序列法进行蛋白鉴别检测并提供检测报告，保证原材料质量可控的前提下，也可采用特征峰测定法研究产品中重组胶原蛋白的鉴别指标（建议结合具体产品，充分排除其他高分子组分干扰，考虑采用适宜的方法，并验证试验方法的可靠性）。

性能指标示例描述（不限于此）为酰胺A带、B带出现在3500～3000cm-1处；酰胺Ⅰ带约出现在1680～1630cm-1处；酰胺Ⅱ带约出现在1640～1500cm-1处；酰胺Ⅲ带约出现在1300～1200cm-1处。参考《中华人民共和国药典》[15]（2020年版）四部0402红外分光光度法，37°C干燥48h测定。

3.4 其他测试法

根据产品组成成分和配比情况，还可以采用高效液相色谱法或其他适当的氨基酸组成分析技术，N-末端测序或质谱法鉴别多肽片段的方法进行重组胶原蛋白的鉴别[4]。

4.有效成分含量测定

导则明确重组胶原蛋白创面敷料注册申报的技术要求测定有效成分的含量，应结合产品实际情况，采用适宜的方法，以重组胶原蛋白为有效成分进行含量测试，可以用质量/重量、质量/体积、百分比等表示。

4.1 凯氏定氮法

性能示例（不限于此）描述为重组胶原蛋白含量应≥0.5mg/g或mg/mL。参考《中华人民共和国药典》[15]（2020年版）四部0731蛋白质含量测定法第一法凯氏定氮法作为测试依据。

4.1.1 常规凯氏定氮法

该方法直接适用于在创面敷料产品原料中除重组胶原蛋白外，不含其他非蛋白类含氮物质。细分为常量法和定氮仪法。凯氏定氮法属于常规型凯氏定氮法检测，方法成熟度高。检测数据准确率高。但如果样品中油性成分比例较大，消化过程需要较长时间，消化温度需要梯度升温。例如180°C之前的梯度温度必须保持至少2h。

4.1.2 改良凯氏定氮法

该方法适用于创面敷料产品原料中除重组胶原蛋白外，还含有其他非蛋白类含氮物质。需要考虑以总氮量减去非蛋白氮量即为创面敷料的含氮量。此种情况下，凯氏定氮法的缺点较为明显，即极易受供试品中复杂辅料成分的影响，导致非蛋白氮提取失败。

4.2 2，2'-联喹啉二羧酸（Bicinchoninic Acid Method，BCA）法

该方法适用于在创面敷料原料中除重组胶原蛋白外，含有其他非蛋白类含氮物质，不具备凯氏定氮法试验条件或者提取非蛋白氮失败的创面敷料产品。

该试验方法在碱性环境下蛋白质分子中的肽键结构与Cu2+络合并将Cu2+还原成Cu+。BCA特异的与Cu+结合形成稳定的蓝紫色复合物，在562nm处有最大的光吸收值并与蛋白质浓度成正比，颜色的深浅与蛋白质的含量成正比，可以根据吸收值测定蛋白质浓度。

BCA工作液总体积=（标准曲线测定点数+样品数）×重复次数×每个样品所需的BCA工作液体积。该方法是已知的最灵敏的总蛋白质含量的检测方法之一，检测下限到0.5µg/mL。而且操作简单易上手，一次可以测定多个样品，具有快速、稳定、灵敏、效率高等优点。但是该方法的线性关系会随着蛋白质含量的增加而越来越偏差，在含有Cu2+的螯合剂、还原性试剂中结果影响较大，在含有大量高分子物质时也容易被包裹而降低回收率。

4.3 福林酚（Folin-Phenol）法

该方法的测试原理为重组胶原蛋白中的肽键和Cu2+发生双缩脲反应，生成蛋白质—铜络合物。同时酚试剂被蛋白质-铜络合物上的芳香族氨基酸残基还原，生成深蓝色的化合物。在一定的条件下，化合物颜色的深浅取决于重组胶原蛋白的浓度。可根据蛋白质溶液的吸光度，定量测定测得样品中重组胶原蛋白的含量。

福林酚法广泛应用于测定水溶性蛋白质的含量，适用于20～250µg微量蛋白质的测定，最低可达5µg/mL。但是福林酚试剂配制繁琐耗，且会受到柠檬酸、甘氨酸、Tris缓冲液、甘油、还原剂（1,4-二硫代苏糖醇、巯基乙醇）、EDTA和尿素等物质的干扰。同时福林酚的反应在进行中需要严格控制反应时间，标准曲线不是严格意义上的直线，专一性较差。对于不同种类的蛋白质，所含酪氨酸的量不同，即使相同浓度下受其他肽类物质干扰，其显色深浅也有所差异。

5.小结与展望

安全性和有效性是重组胶原蛋白创面敷料注册上市环节最重要的两个考量指标，本文结合技术审评经验和部分审评案例，从产品不可吸收方法选择和模型设计、物理阻隔层测试方法和效果评价、有效成分鉴别分析、有效成分含量测定的四方面梳理了重组胶原蛋白创面敷料的关键性能指标，介绍了目前常采用的检验方法，提供了一些证明重组胶原蛋白创面敷料安全有效性能的设计方案，归纳分析了不同鉴别含量测试方法的优势和缺点。为注册申请人提供了申报参考、开拓了研究思路，也有利于统一各省技术审评人员对重组胶原蛋白创面敷料的审评标准和尺度。除此之外，注册申请人和技术审评人员还应充分评价重组胶原蛋白创面敷料的生物相容性、选择适用的临床评价路径，提高对医疗器械全生命周期的安全有效性的整体认识和风险把控，从而促进第二类重组胶原蛋白创面敷料产品的高质量健康发展。