霍山石斛和西洋参配伍对环磷酰胺诱导的大鼠血虚证模型治疗作用研究

张小勇 邵银盈 薛晓辉 孟广东

血虚证为中医临床常见的症候群之一，表现为唇舌面淡白，毛发无光泽，脉细弱、头昏乏力。其主要原因是血液亏虚，不能滋养经络、脏腑。血液亏虚由两方面原因所致，一方面是相关脏腑功能减退，血液来源不足，另一方面是血液损耗太多，多因大量出血或者大病、久病、劳神太过而致[1-2]。

霍山石斛俗称米斛，正式载入2020 版《中国药典》，具有益胃生津，滋阴清热的功效。西洋参为五加科人参属植物，功能以补益为主，能够清热生津，补气养阴。现代研究表明，霍山石斛富含多糖、生物碱、黄酮、蛋白质、氨基酸和联苄类化合物等多种成分，在抑制肿瘤、提高免疫、抗衰老、抗氧化、抗白内障和肝损伤保护等方面具有较强的药理活性[3]。贫血小鼠使用西洋参茎叶总皂甙后，可明显促进红细胞总数（RBC）、血红蛋白（HB）、骨髓有核细胞（BMC）、血小板（PLT）的数值提高，抑制白细胞总数（WBC），WBC数值降低（P＜0.05），加快贫血小鼠造血功能的恢复[4]。本研究建立血虚证大鼠模型，考察霍山石斛和西洋参破壁饮片配伍使用对血虚证的治疗作用，为霍山石斛、西洋参合用治疗血虚证提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物 SPF级SD大鼠60只，雌雄各半，体质量（220±20）g，许可证号：SCXK（苏）2017-0003，于安徽中医药大学动物房常规饲养，室温（20±5）℃，湿度40%～70%的环境下。实验动物颗粒饲料的生产许可证为京饲证（2019）06076，本实验经伦理委员会批准（编号：2021DW005）。

1.2 药物与试剂 环磷酰胺（ 生产批号20092225）。当归补血口服液（ 生产批号012011181）；霍山石斛（生产批号20191153）；西洋参（生产批号19023354）。Rat IL-2 ELISA Kit（ 批号A30200842）；Rat IL-6 ELISA Kit（ 批号A30601231）；Rat EPO ELISA Kit（ 批号Q81LJ8U2N1）；Rat MCSF ELISA Kit（ 批号UH8N57E56A）。

1.3 实验仪器 迈瑞Mindray全自动血液细胞分析仪BC-5390CRP；酶标仪；低速大容量离心机；电子天平；HJ-4A恒温磁力搅拌器。

1.4 实验方法

1.4.1 建立环磷酰胺诱导的大鼠血虚证模型 大鼠常规饲养1 周后，对除正常组以外的所有大鼠腹腔注射环磷酰胺30 mg/kg，建立大鼠血虚模型，给药容积0.3 mL/100 g，连续给药4 d。

1.4.2 分组与给药 将大鼠随机分为正常组、模型组、阳性对照组（当归补血口服液）、霍山石斛和西洋参高（1.8 g/kg）、中（0.9 g/kg）、低（0.45 g/kg）剂量组，共6 组。阳性对照组大鼠以2.0 mL/kg的剂量给药当归补血口服液。分别制备霍山石斛和西洋参破壁饮片，按比例混合后加纯化水制成混悬液，每天给药一次，给药容积1 mL/100 g，正常组和模型组给予等体积的生理盐水，连续给药14 d。

1.5 检测指标 ①大鼠的一般状态观察：观察给药期间大鼠的精神状态、活跃度、毛色、尾、爪色泽、食量等基本情况，每隔7 天称重一次，记录体质量。根据体质量变化按给药标准调整剂量。②外周血象指标的检测：给药14 d后，提前对所有大鼠禁食不禁水12 h。将实验大鼠称重后用10%水合氯醛（0.3 mL/100 g）进行麻醉。取腹主动脉血样2 mL，注入EDTA-K2 抗凝管中，用全自动血液细胞分析仪分析抗凝管中的血样，测定血象指标：白细胞计数（WBC）、血小板计数（PLT）、红细胞计数（RBC）、淋巴细胞百分比（LYM）和血红蛋白（HGB）。③免疫和造血相关因子水平检测：取腹主动脉血样5 mL注入无抗凝剂的采血管中，离心取血清，置冻存管中，于-20 ℃储存待检。检测时按照ELISA试剂盒中的说明书，依次在标准孔和样品孔中加入相应试液，加检测抗体，孵育，洗板，各孔加入底物，孵育，加终止液，制标准曲线检测血清中免疫相关因子（IL-2、IL-6）和造血相关因子（EPO、M-CSF）水平。④胸腺指数和脾脏指数的检测：采集大鼠的胸腺和脾脏组织将其用滤纸吸去表面液体，称重记录。以下述公式计算脏器指数（OI）：脾脏指数（g/kg）=脾脏质量/ 体质量；胸腺指数（g/kg）=胸腺质量/体质量。

1.6 统计学方法 本次实验数据采用SPSS 22.0统计学软件进行处理分析，计量数据采用（±s）表示，各组数据的比较采用单因素方差分析。P＜0.05 表示差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1 大鼠体质量和一般状态观察结果比较 正常组大鼠活动敏捷，反应迅速，食量正常，模型组大鼠的活跃度下降，精神状态不佳，目光呆滞，毛发无光泽且耳、尾颜色明显变苍白，饮食和饮水量减少。给药组大鼠较模型组上述症状均有明显改善。给药7 天后，模型组大鼠体质量明显下降，与正常组相比差异显著（P＜0.01）。与模型组相比，阳性对照组与霍山石斛和西洋参高剂量组大鼠体质量有所提高，差异具有统计学意义（P＜0.05）。霍山石斛和西洋参给药组对于体质量的影响呈现剂量依赖性，高剂量对于体质量的提高优于中、低剂量，差异具有统计学意义（P＜0.05）。见表1。

表1 霍山石斛和西洋参对大鼠体质量的影响（±s，n=10）

表1 霍山石斛和西洋参对大鼠体质量的影响（±s，n=10）

注：与正常组比较，★★P＜0.01；与模型组比较，#P＜0.05

组别体质量（g）给药第1天 给药第7天 给药第14天正常组234.46±21.20 271.86±39.15 292.97±24.19模型组235.28±21.34 215.85±19.61★★220.7±13.53★★阳性对照组233.90±23.68 243.57±33.70# 257.94±19.62#霍山石斛和西洋参高剂量组236.53±21.58 242.51±30.52# 258.96±19.43#霍山石斛和西洋参中剂量组236.57±19.81 240.18±31.25 243.77±15.39霍山石斛和西洋参低剂量组239.62±24.48 234.55±13.69 224.23±18.98

2.2 霍山石斛和西洋参对外周血象的影响 与正常组相比，模型组大鼠外周血象中的WBC、PLT、RBC、LYM、HGB水平下降趋势明显，差异具有统计学意义（P＜0.01）。各给药组对于外周血液均有一定程度的改善作用，与模型组相比较，霍山石斛和西洋参高剂量组大鼠外周血液中上述5个指标水平显著升高，差异具有统计学意义（P＜0.05 或P＜0.01）；霍山石斛和西洋参中剂量组大鼠外周血液中WBC、PLT、RBC水平显著升高（P＜0.05 或P＜0.01）；霍山石斛和西洋参低剂量组大鼠外周血液中WBC、PLT水平显著升高（P＜0.01）。见表2。

表2 各组大鼠外周WBC、PLT、RBC、LYM和HGB水平检测结果比较（±s，n=10）

表2 各组大鼠外周WBC、PLT、RBC、LYM和HGB水平检测结果比较（±s，n=10）

注：与正常组比较，★★P＜0.01；与模型组比较，#P＜0.05，##P＜0.01

组别WBC(109/L)PLT(109/L)RBC(109/L)LYM(%)HGB(109/L)正常组4.24±1.61707.09±88.986.92±0.3169.41±7.58139.9±5.58模型组0.10±0.06★★94.53±14.19★★4.92±0.39★★42.92±4.85★★98.75±9.52★★阳性对照组0.29±0.15##202.23±44.76##5.66±0.34##53.56±5.71#116.44±10.33#霍山石斛和西洋参高剂量组0.27±0.05##181.62±32.88##5.62±0.32##52.77±5.46#115.00±5.39#霍山石斛和西洋参中剂量组0.21±0.06##179.33±25.04##5.52±0.30#48.93±5.68113.33±6.65霍山石斛和西洋参低剂量组0.20±0.02##149.00±26.54##5.23±0.4744.20±6.44109.63±11.27

2.3 霍山石斛和西洋参对免疫和造血相关因子的影响 与正常组相比较，模型组大鼠血清中IL-2、IL-6、EPO、M-CSF水平具有显著差异（P＜0.01）。各给药组对于免疫和造血相关因子水平均有不同程度的改善趋势，与模型组相比，霍山石斛和西洋参高剂量组大鼠IL-2、IL-6、EPO、M-CSF水平显著升高（P＜0.05 或P＜0.01），霍山石斛和西洋参中剂量组大鼠M-CSF水平显著升高（P＜0.01），霍山石斛和西洋参低剂量组大鼠IL-2、IL-6、EPO、M-CSF水平差异无统计学意义（P＞0.05）。见表3。

表3 各组大鼠血清中免疫和造血相关因子水平测定结果比较（± s，n=10）

表3 各组大鼠血清中免疫和造血相关因子水平测定结果比较（± s，n=10）

注：与正常组比较，★★P＜0.01；与模型组比较，#P＜0.05，##P＜0.01

组别IL-2(pg/L)IL-6(pg/L)EPO(ng/L) M-CSF(pg/L)正常组1016.46±91.90 561.43±89.94 2.62±0.43 235.58±28.80模型组761.82±39.48★★ 103.5±13.51★★ 1.73±0.19★★112.42±14.94★★阳性对照组 842.80±90.44# 139.95±22.68## 2.48±0.23## 191.32±26.28##霍山石斛和西洋参高剂量组 836.75±70.42# 124.15±16.95# 2.45±0.31# 177.41±24.06##霍山石斛和西洋参中剂量组 772.94±31.60122.79±17.24 2.19±0.24 163.98±12.99##霍山石斛和西洋参低剂量组 755.59±46.19118.39±24.46 2.04±0.37 136.76±16.12

2.4 霍山石斛和西洋参对胸腺指数和脾脏指数的影响 与正常组相比，模型组大鼠胸腺和胸腺指数下降明显，差异具有统计学意义（P＜0.05或P＜0.01）。与模型组比较，阳性对照组及霍山石斛和西洋参高剂量组对于大鼠胸腺和脾脏指数有升高的趋势，差异具有统计学意义（P＜0.05）；霍山石斛和西洋参中剂量组及其低剂量组大鼠胸腺和脾脏指数比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。见表4。

表4 胸腺指数和脾脏指数的测定结果比较（±s，n=10）

表4 胸腺指数和脾脏指数的测定结果比较（±s，n=10）

注：与正常组比较，★P＜0.05、★★P＜0.01，与模型组比较#P＜0.05

组别脏器指数(g/kg)胸腺脾脏正常组2.40±0.213.71±0.77模型组1.22±0.24★ 1.77±0.23★★阳性对照组1.53±0.22#2.15±0.16#霍山石斛和西洋参高剂量组 1.52±0.14#2.37±0.20#霍山石斛和西洋参中剂量组 1.41±0.171.86±0.29霍山石斛和西洋参低剂量组 1.08±0.091.80±0.31

3 讨 论

中医理论认为，气血密切相关，气能生血，血不足者可补气以生之，达到不治而治的目的。研究发现，西洋参能明显升高血红蛋白、红细胞和血小板的数量，证实了“气能生血”这一中医理论的正确性[5]。西洋参不仅补气，且同霍山石斛兼具生津功效，因此霍山石斛和西洋参合用补血，具有中医理论基础。通过实验观察，给药组大鼠体质量增加，活动增多，亦符合古籍记载霍山石斛具有“补五脏虚劳羸瘦”之功效。现代研究表明，铁皮石斛能够增加脾虚便秘型小鼠血小板比容、红细胞比容，血小板计数、红细胞数量，降低白细胞和淋巴细胞数量，使其恢复至正常水平[6]。霍山石斛与铁皮石斛同科同属，以此作为切入点，研究霍山石斛补血作用，具有现代药理学基础。

血虚证造模的方法有失血法、溶血法、辐射损伤法、营养法、化学损伤法等多种方法[7]。本实验采用环磷酰胺化学损伤法建立血虚证模型，环磷酰胺是典型的抗肿瘤药，具有显著的骨髓抑制作用，可引起骨髓造血干细胞损伤，外周血细胞下降，大鼠血虚证造模常用此法[8]。通过对实验动物的一般状态的观察发现，实验动物在造模期间活跃度明显下降，耳、尾明显苍白，体质量下降，精神状态萎靡，符合中医血虚证的临床表现。进一步对模型组大鼠外周血象各项指标的检测发现，其WBC、PLT、RBC、LYM、HGB与正常组差异具有统计学意义（P＜0.05 或P＜0.01），由此可推断环磷酰胺已经抑制了实验动物的骨髓造血功能，血虚证大鼠模型成功建立。

中药破壁饮片是指将符合国家法定标准的植物类中药饮片，采用现代加工技术，粉碎至D90＜45μm（300 目以上），可供直接口服的中药饮片粉末。与传统饮片相比，其优点是能够保留全成分，有利于有效成分的释放和溶出[9]。目前，中医临床上对于中药破壁饮片的应用越来越广泛，比如呼吸系统疾病、心脑血管系统疾病、神经系统疾病等[10-11]。本次实验采用霍山石斛和西洋参破壁饮片对血虚证大鼠模型进行治疗，结果表明破壁饮片的治疗效果明显。因霍山石斛市场价格较高，破壁成粉末亦符合我国贵重药材的使用传统，因此，霍山石斛破壁饮片使用对药品开发具有一定指导意义。本研究发现，霍山石斛和西洋参破壁饮片对于外周血象指标WBC、PLT、RBC、LYM、HGB水平以及相关的细胞因子IL-2、IL-6、EPO、M-CSF水平均有提高的趋势，能提高大鼠胸腺和脾脏指数，呈现出剂量依赖性，高剂量比中、低剂量的治疗效果好。

综上所述，本研究表明霍山石斛和西洋参配伍对血虚证有一定的治疗作用，但具体的临床应用效果还需进一步研究。