外泌体调控胚胎发育的研究进展

卢永昌,甘建宇,黄思秀,洪林君

(华南农业大学 动物科学学院,国家生猪种业工程技术研究中心,广东 广州 510642)

胚胎的正常生长发育需要与母体之间建立正确的信息交流,胚胎在子宫中所处的微环境直接影响到胚胎的生长发育。外泌体作为胚胎生长发育的重要调控因子之一,其中所含物质的变化有可能会导致胚胎生长发育受阻甚至死胎[1]。近年来,外泌体在调节胚胎微环境影响胚胎生长发育的机制正受到越来越多的关注。但研究主要聚焦于外泌体中的一些蛋白质、RNA或其他因子的含量变化,对于外泌体在胚胎发育过程的具体影响作用机制的研究尚没有特别深入,因此深入分析外泌体所含物质对胚胎发育的调控作用能够有效提高胚胎成活率,有力推动家畜的遗传选育。本文对外泌体与胚胎发育间的联系做一综述,以期对外泌体对胚胎发育的影响机制提供参考。

1 外泌体概述

外泌体(Exosome)是内源性脂质纳米粒(LNP)与细胞内的多囊小体融合后,通过细胞间的囊泡转运机制主动分泌到细胞外液中的一种细胞外囊泡(Extracellular vesicles,EVs)[2],直径约为30～100 nm[3]。Salamonsen等[4]在2013年首先报道了人子宫内膜上皮细胞系ECC1可以产生EVs,并证实了子宫腔液中存在外泌体。研究发现,外泌体对人[5]、大鼠[6]、牛[1]、羊[7]和猪[8]等多种哺乳动物的妊娠过程和胚胎发育过程发挥着重要作用,并具有免疫调节、调控细胞分裂、分化、抗氧化等多方面的功能。对母胚交流、胚胎发育有影响作用的外泌体主要来源于胎盘[9]、子宫内膜[4]和胚胎[10],且不同器官产生的外泌体有着不同的功能,其引起介导作用的程度也均不相同[11-16]。胚胎产生的外泌体能够在母体的子宫内膜中被发现,而胚胎同样可以吸收子宫内膜中产生的外泌体,从而对自身的发育起到影响作用[10]。这意味着外泌体的相互传递是母体与胚胎之间的一种交流形式[17],也反映了不同来源的外泌体具有相互影响的作用。

2 外泌体对胚胎发育的影响

胚胎以外泌体为媒介与母体子宫内膜“沟通”。存在于外泌体内的RNA(如microRNA (miRNA)、mRNA、长非编码RNA (lncRNA)、环状RNA (circRNA)等[11])一般被统称为外泌体穿梭RNA (esRNA)。esRNA在与靶细胞膜转运结合过程中传递到靶细胞基质中,并通过多个机制影响着细胞的生命活动[19]。外泌体中的部分内容物在促进胚胎附植、调控基因表达、影响组织器官形成等方面发挥着重要作用。

2.1 胚胎发育过程

输卵管中精子与卵子通过受精作用融合发育成为受精卵。受精卵在透明带中不断卵裂,在经历多次有丝分裂过程后进入桑葚胚期。受输卵管生理环境影响,桑葚胚之前较容易出现发育阻滞和胚胎衰老现象[20],因此早期胚胎发育主要受输卵管环境调控[21]。随着胚胎的不断发育,在受精后6 d左右(如,猪需要5～6 d,牛7～8 d,羊6～7 d)[22],胚胎细胞开始分化进入囊胚期,此时囊胚游离于子宫腔液中,并处于自由状态。囊胚从透明带(ZP)的孵化是胚胎发育过程中的一个关键过程,以猪为例,这个过程大约在第8天时结束。这一阶段由于早期精卵细胞较弱,受精卵的活力低,因此容易死亡并被母体吸收。囊胚向子宫移动一段时间后,最终附植在子宫内血管稠密的地方。附植的部位以及附植的方式在各种动物中存在较大差异。猪的胚胎通常附植于子宫角子宫系膜的对侧,由于大量滋养层细胞与子宫内膜靠接、粘连逐渐形成弥散型上皮绒毛膜胎盘,微绒毛在子宫内膜的陷窝中与母体子宫上皮交错伸入即完成胚胎的附植。这个时期的胚胎将面临发育过程中的首个死亡高风险时期[23]。这一时期的宫内环境是胚胎死亡的关键因素,大多数有染色体疾病的胚胎在此阶段死亡。据报道,猪在附植期间胚胎死亡率可以达到30%～40%[24]。存活的胚胎继续发育形成器官,此阶段母畜会分泌大量有利于胚胎器官形成的蛋白质[25],此时胚胎开始形成竞争关系,竞争力弱的胚胎因死亡而被淘汰,因而此阶段也成为了胚胎第二个死亡高风险时期。在妊娠的中后期,胚胎还会经历发育过程中的第三个死亡高风险时期,由于胚胎快速发育,子宫内营养物质分布不均,导致一些胚胎死亡[25]。

2.2 外泌体miRNA对胚胎发育的影响

胚胎外泌体RNA中最丰富的是miRNA。miRNA约由22个核苷酸组成,在细胞间物质运输过程中发挥信号转导和功能基因表达调控作用[26-28]。外泌体miRNA主要通过调控靶基因表达来增加胚胎粘附能力,促进胚胎附植的作用。如Vilella等[5]通过微阵列分析显示母体来源的外泌体miRNA可能起到附植前胚胎的转录修饰作用,其中在附植窗口期的子宫内膜上皮表达水平上调最显著的是由腺上皮主动产生的miR-30d,其通过外泌体分泌到子宫内膜腔内并被胚胎内化并上调Itgb3、Itga7和Cdh5等粘附分子的表达来增加胚胎粘附。Gurung等[29]发现,与子宫内膜上皮细胞分泌的其他成分相比较,外泌体对早期胚胎的发育和附植过程有更为显著的作用,尤其是外泌体中的miRNA能有效提升细胞黏附等相关基因的表达,从而让子宫与胚胎的黏附更加稳固,使胚胎附植率显著增加。外泌体中的miRNA不仅能够通过外泌体运输至胚胎中发挥作用[30],也能作为预测胚胎质量和判断胚胎生长发育的指标[31]。Hu等[32]发现,在猪中不同大小的卵泡所产生的外泌体中的miRNA的表达也存在差异,并确定了猪卵母细胞的成熟十分重要的miRNA:miR-125b、let-7d-5p、miR-200b、miR-26a和miR-92a。因此,这些外泌体miRNAs可作为分子生物标志物来选择高质量的卵母细胞,同时也可猜测这些外泌体miRNAs有可能与胚胎的高质量发育有一定的关系。此外少量miRNA与组织器官的形成和发育有关。Bidarimath等[30]收集并鉴定猪子宫内膜、绒毛膜、尿囊膜、滋养外胚层和主动脉壁细胞释放的外泌体,发现外泌体中的miRNA与血管形成有关。据此推测,外泌体miRNA能通过调控基因表达影响卵泡发育、胚胎黏附能力和组织器官形成,进而影响胚胎发育。与胚胎发育相关的外泌体miRNA见表1。

表1 与胚胎发育相关的外泌体miRNA

2.3 外泌体lncRNA对胚胎发育的影响

lncRNA是生物体中重要的生物活性物,由200多个核苷酸组成,不具有或只具有有限的蛋白质编码能力[38]。早期对lncRNA的研究主要集中在胚胎发育过程中的基因印记和剂量补偿效应方面[39-40]。研究表明,lncRNA还参与了许多其他的生理过程,例如细胞分裂、细胞分化和先天免疫反应的调节[41-42],由此猜测外泌体中的lncRNA在胚胎发育过程中对细胞分裂和分化也有一定的影响。近年来,研究发现有大量的lncRNAs在胎盘组织和外周组织存在差异表达。Wang等[43]和Kelemen等[44]也发现,一些外泌体中富含特定的lncRNA,同时也存在其他很少见的lncRNA,这证明lncRNAs也可以选择性地分泌到外泌体中。这些lncRNAs可以多维调节胎盘滋养细胞的生理功能和参与血管生成的调控,从而影响胚胎的发育情况[45]。也有报道称,外泌体衍生的lncRNA可调节细胞凋亡、增殖、迁移并诱导血管生成[46-47]。Gong等[48]发现间充质干细胞能通过分泌外泌体运输lncRNA H19,从而分别下调和上调胎盘组织中的miRNA let-7b和转录因子FOXO1的表达,使细胞的侵袭和迁移增多,同时也抑制滋养细胞凋亡。因此,子宫腔液外泌体中的lncRNAs是否能正常表达对胚胎发育以及滋养层细胞的功能具有重要的影响。

2.4 外泌体蛋白对胚胎发育的影响

外泌体中的蛋白质通常可分为胞内蛋白和膜蛋白。外泌体中的不同蛋白质执行不同的功能[49-50]。已经证实,在胚胎附植期间,外泌体蛋白在母体和胚胎之间的信息传递中起作用[51]。外泌体蛋白中没有内质网、高尔基体、核相关蛋白[52],主要蛋白为CD81、CD63、CD9、溶酶体相关膜蛋白1(LAMOP1)、凋亡转移基因-2-相互作用蛋白X(Alix)和肿瘤易感基因101蛋白 (TSG101)[53-56]。外泌体中主要蛋白及功能见表2。

表2 外泌体中主要蛋白及其功能[57]

研究发现,在泛素化修饰过程中,转运必需核内体复合体 (Endosomal complex requned for transport,ESCRT) 通过介导并调节Fas配体进入外泌体,这一过程对于保持外泌体蛋白水平和功能具有重要意义[58]。由于ESCRT机制在外泌体产生过程中的作用以及在外泌体中存在的一些ESCRT的亚单位,人们才能通过操纵ESCRT来调节外泌体的形成。同时外泌体中的蛋白质与外泌体的形成和功能密切相关。例如,小的GTP结合蛋白家族 (Rab27a,Rab11b,ARF6) 参与外泌体的形成和释放[59]。外泌体的蛋白不仅与外泌体自身有关,还与胚胎发育过程中胚胎的孵化和附植有密切关系。Gurung等[29]在外泌体蛋白质组学研究中确定了外泌体中蛋白酶的存在,包括水解酶(酯水解酶(Ester hydrolase)、二甲氨基水解酶1(Dimethylarginine dimethylaminohydrolase 1)、酯酶D(Esterase D)、博莱霉素水解酶(Bleomycin hydrolase)外切核苷三磷酸二磷酸水解酶2(Ectonucleoside triphosphate diphosphohydrolase 2))和金属蛋白酶(ADAM金属肽酶含血小板反应蛋白1型15(ADAM-TS15)),这些蛋白酶都可以促进透明带裂解和提高胚胎孵化,同时通过分析特异性差异蛋白谱还表明,外泌体具有与细胞迁移、粘附和ECM相关的独特因子。此外,外泌体还可以在免疫系统的调节中发挥重要作用[60]。据此推理,外泌体中绝大多数蛋白都是直接以信号分子的形式转运到靶细胞中,从而调控胚胎的发育过程。综合上述分析表明,外泌体所含的蛋白种类对母胚交流与胚胎发育具有深远的影响,而通过蛋白质组学分析其表达的差异及具体调控机制具有重要意义。

3 小结与展望

综上所述,外泌体中一些RNA、蛋白质及信号分子主要通过调节基因表达、胚胎-母体通讯、细胞周期、细胞分化、先天免疫反应和胚胎附植等方式来发挥对胚胎发育的调控作用,但其调控机制目前尚未有系统的解析。因此,可在胚胎发育时期进一步分析外泌体内容物的功能,并通过有效的分析技术获得表达谱,尤其是存在差异表达的内容物,这对研究外泌体对胚胎的调控作用机制,尤其是在胚胎死亡高峰时期的调控机制具有重要研究意义。通过不断发现外泌体对胚胎发育的作用机制,进一步提高妊娠繁殖效率、促进遗传育种学科发展,从而更好地为畜牧行业服务。