湖州地区杂草稻遗传多样性分析及防治策略初探

赵德琪，谷刚，孟华兵，张齐彦，尚年军，陈伟，陈雷*

(1.湖州洁田模式生物科技有限公司，浙江 湖州 313000；2.湖州市吴兴区农业技术推广服务中心，浙江 湖州 313000；3.稻丰农业有限公司，浙江 湖州 313000；4.湖州市吴兴区东林镇农业农村办公室，浙江 湖州 313000)

杂草稻是水稻田间最主要的危害性杂草之一。杂草稻与水稻亲缘关系相近，具有早熟、易落粒、休眠性强和繁殖系数高等特点，在稻田中与栽培稻争夺水分、肥料、光照等资源，导致稻米品质差，产量低，严重损害了栽培水稻的产量和质量[1]。杂草稻前期生长与普通栽培稻无明显差异，但后期生长加快，在抽穗扬花期通常比栽培稻高大。由于杂草稻和栽培稻在生理生化性状方面的相似性，利用稻田常用的选择性除草剂无法做到防除杂草稻的同时不伤害栽培稻，一般采用后期人工拔除杂草稻植株或割除杂草稻穗子等方法进行防控[2]。水稻直播栽培为杂草稻种子萌发生长创造了有利条件，随着水稻直播等轻简化技术的广泛应用，杂草稻在我国部分地区发展迅速，给粮食生产造成严重影响[3]。

水稻为湖州市主要粮食作物，受农业劳动力制约和土地流转进程影响，栽培模式逐渐由传统的精耕细作向轻简化栽培改变[4]。目前，湖州市水稻直播(含机直播和无人机播种)面积超过80%，稻田杂草群落、草害情况与20世纪末相比发生了巨大变化，杂草稻已经成为主要杂草危害，在部分田块甚至达到中度危害水平[5]。

对杂草稻群体遗传多样性的调查研究，有助于了解湖州地区的杂草稻来源与种群分布，能帮助农户从源头控制杂草稻危害的发生。SSR标记具有快速、稳定、准确、且不受环境因素影响等特点[6]，本研究采用SSR标记对在湖州地区采集的杂草稻样品进行了遗传多样性分析，并开展了杂草稻的表型特征调查。

乙酰乳酸合成酶(ALS)抑制剂是通过其干扰ALS与底物结合来抑制植物支链氨基酸生物合成的一类除草剂[7]。在水稻的ALS基因上发生特定的碱基突变，会使水稻获得对ALS抑制剂类除草剂的抗性[8]。利用抗除草剂水稻和相应的选择性除草剂，可以达到杀死杂草稻却不影响栽培稻生长的目的，是防治杂草稻的有效手段[9]。因此，本研究进一步调查了湖州地区杂草稻对于ALS抑制剂类除草剂的抗性，探索了利用非转基因抗除草剂水稻和ALS类抑制剂结合，控制湖州地区杂草稻危害的可能性。

1 材料与方法

1.1 材料采集

本研究所用杂草稻材料均于2019年9-10月从湖州水稻田间采集，此时正值水稻和杂草稻成熟期，易于分辨。采集地点遍布湖州市两区三县，主要来源于杂草稻频发的吴兴区东林镇东华村、吴兴区东林镇保永村、吴兴区八里店镇紫金桥村、德清县洛舍镇陆家湾村、南浔区菱湖镇千丰村、长兴县画溪街道包桥村、长兴县画溪街道南石桥村、安吉县梅溪镇荆湾村。共采集到15个杂草稻样品，均具有典型的杂草稻特征，如早熟、易落粒、多数种皮红色等，并根据采集地点进行了编号(图1)。

该图基于浙江省地理信息公共平台网站下载的审图号为浙S(2023)28号的标准地图制作，底图无修改。图1 杂草稻种子采集地分布图Fig.1 Distribution of weedy rice seed collection sites

1.2 实验方法

1.2.1 遗传多样性分析

15个杂草稻样品的自交F1代幼苗按照20 cm×20 cm的间距插秧种植于田间，每个杂草稻样品种植4行8列共32株，组成15个小区。在生长过程中按照《水稻DUS测试指南》中规定的性状描述方法对表型性状进行记录。采集各株系叶片，使用CTAB法提取DNA。参照中华人民共和国农业行业标准NY/T 1433-2014《水稻品种鉴定技术规程 SSR标记法》中推荐的48对引物，对这15个株系进行特异性扩增，并进行遗传多样性分析。PCR反应体系为：10×TaqPCR Buffer 1.0 μL，dNTPs 0.1 μL，AccurateTaqDNA Polymerase 0.1 μL，上下游引物各0.1 μL，DNA模板0.1 μL，加水补至10 μL。PCR反应条件为：95 ℃预变性5 min，然后95 ℃变性30 s、56 ℃退火30 s、72 ℃延伸30 s，共计35个循环。PCR产物在聚丙烯酰胺凝胶中电泳90～120 min后进行银染操作，在凝胶成像仪上观察扩增结果。

1.2.2ALS基因序列分析

取杂草稻叶片，CTAB法提取DNA，在NCBI网站搜索ALS基因的cDNA序列(登录号：AB049822)，利用Primer Premier 5软件设计如下引物：ALSF，5′-CCATCCGAGCCACACATCGCCTC-3′；ALSR，5′-ACAAACATCATAGGCATACCACTC-3′。

通过PCR扩增ALS基因。PCR扩增体系为：DNA模板1 μL，10×Buffer 5 μL，25 mmol·L-1MgSO42 μL，2 mmol·L-1dNTPs 5 μL，10 μmol·L-1Primer 各1.5 μL，1 U·μL-1KOD-Plus 1 μL，加水至50 μL。PCR扩增程序：94 ℃预变性2 min，然后94 ℃变性10 s、58 ℃退火30 s、68 ℃延伸2 min，35个循环。PCR产物经过1.5%(V/m)琼脂糖凝胶电泳分离，目的条带用DNA凝胶回收试剂盒纯化后送公司测序。

1.2.3 除草剂喷施试验

将15个杂草稻样品及洁田稻001共同种植于盆中，待水稻植株长至三叶一心期进行茎叶喷雾，使用甲咪唑烟酸作为喷施药剂，喷施剂量为108 g·hm-2，喷雾量为450 L·hm-2。于施药后15 d观察并统计植株生长状态及死亡情况。

1.2.4 落粒性调查

为了高效且准确地对比各杂草稻的落粒性，使用数字测力计(ELK-10，伊莱科电气)对水稻穗-粒分离力(BTS)进行测量。测量方法为将数字测力计水平固定在桌面上，用测力计上的夹子夹住穗的基部，再用镊子夹住谷粒，使测力计、穗子、谷粒在同一直线上，拉动谷粒致其从穗上分离，记录分离力。在完熟期取样，每小区随机选取4个单株，每株随机取3个穗子，每穗均匀选取6个一次支梗，每支梗随机测量3粒种子的分离力，记录分离力数据，并进行计算分析。

2 结果与分析

2.1 表型性状调查结果与分析

在植株的生长周期内分别采集了15个杂草稻株系的株叶型、株高、粒型、粒长、粒宽等数据，使用《水稻DUS测试指南》中规定的性状描述方式对表型性状进行测定(表1)，并记录了各株系的株叶形态影像(图2)。对比结果表明，湖州地区杂草稻表型多样化程度高，15个杂草稻样品表型差异显著。在株叶形态方面，从紧凑株形到松散株形均有分布；株高相差大，最高的株系株高111.46 cm，最矮的株系仅高89.92 cm，株高相差21.54 cm；播始历期从72～92 d，最高相差20 d；植株芒长方面，存在长芒、短芒和无芒株系的区别；在籽粒方面，种皮均为红色，籽粒形态表现相近，但在粒长、粒宽上有细微的差异。

表1 杂草稻的表型数据Table 1 Phenotypic data of weedy rice

图2 杂草稻单株的株叶形态Fig.2 Leaf morphology of weedy rice plants

使用数字测力计对杂草稻和对照洁田稻001、武运粳的穗-粒分离力(BTS)进行测量，每个杂草稻小区共检测12穗，每穗检测18粒谷粒的穗-粒分离力，求平均数得到每个小区的平均拉力值(表1)。其中，以洁田稻001为籼稻栽培稻对照，以武运粳为粳稻栽培稻对照。结果显示，湖州地区的杂草稻穗-粒分离力平均值分布在0.28～0.79 N，均小于栽培稻洁田稻001的1.18 N和武运粳的1.68 N。15个杂草稻株系的平均穗-粒分离力为0.63 N，仅为洁田稻001的53.7%和武运粳的37.7%。采用Kruskal-Wallis test进行差异显著性分析，发现武运粳、洁田稻001和15个杂草稻单株的穗-粒分离力数据存在显著差异(P<0.05)。充分体现了杂草稻落粒性强于栽培稻的特点。

2.2 SSR多态性分析

将电泳结果统计为0-1矩阵，使用Dataformater进行数据转换[10]，再使用Popgen32软件进行分析，得到多态性分析结果(表2)。有41对引物的产物具有多态性，占总数的85.4%。在具有多态性的41对引物中，共检测出104个等位位点，平均等位基因数量为2.312 5。呈现单态位点的引物有7个，分别是RM443、RM267、RM339、RM17、RM176、RM316和RM7102。多态性最丰富的引物为RM481，有5个等位位点(图3)。多态信息量(PIC)平均值为0.313 8，最高值0.581 1(引物RM481)，最低值0.110 3(引物RM19)。其中，多态性高(PIC值>0.5)的引物有2个(RM219和RM481)；多态性中等(0.5>PIC>0.25)的引物有23个；平均PIC值为0.313 8，呈现中等多态性。平均等位基因数量为2.312 5，平均有效等位基因数量为1.577 2，二者差值为0.735 3；等位基因数量(Na)与有效等位基因数量(Ne)差值最大的引物是RM208，差值为2.469 4，等位基因分布最为不均；差值最小的引物是RM590，差值为0.008 8，等位基因分布最为均匀。Shannon信息指数(I)表示群体遗传多态度，是一种基于信息理论的测量指数，数值越大，表明遗传多态度越高。本研究中I的平均值为0.515 4，最高值1.229 3(引物RM481)，最低值0(引物RM443、RM267、RM339、RM17、RM176、RM316和RM7102)。

表2 SSR引物多态性分析结果Table 2 SSR primer polymorphism analysis

M为DNA Marker B 100～600 bp。图3 RM481标记扩增结果Fig.3 Amplification results of RM481 marker

2.3 遗传相似度与聚类分析

使用NTSYS软件对SSR结果进行计算，得到遗传相似系数矩阵(表3)和聚类分析图(图4)。分析可知，本次搜集的15个杂草稻单株的平均遗传相似系数为0.714 5；最大的遗传相似系数为1，分别是编号为W1、W2、W3和W4，W12和W14，W11、W13和W15的杂草稻，可以认为上述各单株组合是同一品种。最小的遗传相似系数为0.387 8，在编号为W7与W10的杂草稻之间产生，表明这2个单株遗传距离最远。此外，以遗传相似系数平均值0.714 5为基数对这15个杂草稻单株进行分类，可得到5个类群(图4)。分别为Ⅰ(W1、W2、W3、W4、W5、W11、W13、W15)；Ⅱ(W8)；Ⅲ(W9、W10、W12、W14)；Ⅳ(W6)；Ⅴ

表3 杂草稻遗传相似系数矩阵Table 3 Matrix of genetic similarity coefficient of weedy rice

聚类分析图由Ntsys软件计算得出，遗传相似系数越接近1则表示遗传相似度越高，越接近0则表示遗传相似度越低。图4 15个杂草稻株系聚类分析图Fig.4 Cluster analysis of 15 weedy rice lines

(W7)。其中Ⅰ组中，8个杂草稻单株分别来自东华村(W1、W2、W3、W4、W5)、包桥村(W11)、荆湾村(W13、W15)，它们之间的最大相似系数为1，最小相似系数为0.959 2。第Ⅲ组中，4个杂草稻单株分别来自紫金桥村(W9)、千丰村(W10)、南石桥村(W12)、荆湾村(W14)，它们之间的相似系数最大值为1，最小值为0.729 2。

2.4 ALS抑制剂类除草剂抗性分析

水稻ALS基因编码乙酰乳酸合成酶，我们测序检测了15个杂草稻样品以及常规籼稻洁田稻001(深圳洁田模式生物科技有限公司提供)的ALS基因序列。以武运粳ALS基因型为粳稻野生型，蜀恢498ALS基因型为籼稻野生型，将洁田稻001基因型设为抗性型。ALS基因型对比发现，15个杂草稻ALS基因均与籼稻野生型比较相近，推测这15个杂草稻株系都存在籼稻血缘。在15个杂草稻株系的ALS基因上存在2种SNP突变类型，我们将其设为杂草稻Ⅰ型，其中包括编号为W9、W10、W12、W15的杂草稻；杂草稻Ⅱ型包括编号为W1、W2、W3、W4、W5、W6、W7、W8、W11、W13、W14的杂草稻(图5)。与已知在水稻中能产生抗性突变的氨基酸位点(OsALS，Gly95，Ala96，Ala129，Pro171，Ala179，Arg315，Asp350，Trp548，Ser627，Gly628)[9]进行比对，结果表明，这32个SNP位点中仅抗性型(洁田稻001基因型)在第1 642、1 643位碱基发生突变会产生抗性。这2个碱基的替换导致水稻乙酰乳酸合成酶第548位点氨基酸由色氨酸突变为甲硫氨酸(W548M)，该突变使水稻具有对咪唑啉酮类除草剂的抗性[9]。而粳稻与籼稻野生型、杂草稻Ⅰ型和杂草稻Ⅱ型均未见对咪唑啉酮类除草剂具有抗性的SNP位点。

图5 已知位点核苷酸序列对比Fig.5 Comparison of nucleotide sequences at known sites

以洁田稻001作为阳性对照，武运粳作为阴性对照，使用甲咪唑烟酸对对照和15个杂草稻株系进行茎叶喷施后发现，大部分杂草稻在7 d后均产生药害，出现心叶发黄、扭曲等症状，在25 d后，所有杂草稻植株死亡。仅洁田稻001生长状况不受影响(图6)。

图6 除草剂喷施结果Fig.6 Herbicide spray results

3 讨论与总结

杂草稻对栽培稻，尤其是对直播稻的危害，在湖州地区正在逐年加剧。仅在长兴县，2012-2017年，杂草稻便随着机械作业传播至全县所有乡镇，总体呈现偏重发生态势(4.8万～7.2万株·hm-2)[11]，有研究[12]表明，当杂草稻达到6万株·hm-2时，栽培稻将减产20%，这对农业生产将是一个巨大的威胁，而研究杂草稻的发生有助于找寻解决办法。关于杂草稻危害是如何发生的，前人[13]提出了3个主要途径，1)随着作物的驯化，野生植株适应栖息地的环境；2)栽培品种与当地近缘野生植株杂交产生；3)栽培品种之间相互杂交产生。正是因为其发生途径较多，导致了各地的杂草稻遗传多样性丰富。

表型分析显示，湖州地区杂草稻从株叶形态、株高、播始历期、芒长度和穗粒分离力多方面展示了丰富的表型性状，体现了较高的表型多样性。SSR多态性分析结果表明，从湖州地区采集的杂草稻样品遗传多态性处于中等水平。聚类分析结果显示，同一杂草稻株系可能会跨区域传播，例如东华村、包桥村、荆湾村等不同区县的杂草稻单株最小相似系数高达0.959 2，可以认为其遗传背景高度相似，属于同一聚类，与宁国云等[11]提出的农业机械跨区作业传播杂草稻种子的情况较为相似；而同一区县的同一个村中，也会存在不同来源杂草稻，例如荆湾村的杂草稻，既有Ⅰ型类群的(W13、W15)，也有Ⅲ型类群的(W14)，表明湖州地区杂草稻来源复杂，遗传多样性丰富。

针对湖州杂草稻的落粒性检测表明，湖州地区的杂草稻落粒性较强，与对照品种存在显著差异，15个杂草稻株系的平均穗-粒分离力为0.632 8 N，仅为籼稻品种洁田稻001的53.7%和粳稻品种武运粳的37.7%。较强的落粒性导致稻谷容易从枝梗上脱落，形成落田谷，导致杂草稻种子的进一步泛滥，造成产量的降低和稻米的品质下降[14-15]。

传统杂草稻防除包括人工拔除、播前深翻地、实施水旱轮作、诱杀杂草稻种子等方法[16]。但是，随着规模化，机械化种植的普及推广，寻求一种适合规模化，简单化的防治方法尤为重要。培育抗除草剂水稻品种，使其具有对特定除草剂的抗性，再与特定除草剂配合使用，即可有效防除杂草稻等近缘杂草。有研究[12]表明，采用抗ALS抑制剂类除草剂的水稻品种防除杂草稻之后，对比常规化学除草产量提高8.54%。通过种植洁田稻001等抗除草剂水稻能有效防除杂草稻，降低杂草稻对栽培稻的危害，并且在防治杂草稻的同时，对该除草剂杀草谱中的杂草亦能起到良好的防除效果，达到节本增效的目的。为了实现这一目标，应当采用传统育种与分子育种相结合的方法，着手选育抗除草剂新品种，同时开发新的除草剂抗性类型，做到品种的有序更新和除草剂的轮换使用，最大限度控制杂草稻危害。