外源GA3和ABA对烤烟内源激素调控效应和常规化学成分的影响

李波，陈小翔，张文军，翟争光，刘化冰，江智敏，徐志强*，

(1.浙江中烟工业有限责任公司 技术开发分公司，浙江 杭州 310008；2.湖南省烟草公司 长沙市公司，湖南 长沙 410000)

赤霉素生物合成前体物质柯巴基焦磷酸和脱落酸生物合成前体物C40环氧类胡萝卜素(epoxycarotenoid)均是由质体中甲基赤藓醇-4-磷酸(methylerythritol-4-phosphate pathway，MEP)途径合成的香叶基香叶基焦磷酸(geranylgeranyl-PP，GGPP)产生的。在赤霉素合成代谢途径中GGPP在柯巴基焦磷酸合酶(ent-copalyl diphosphate synthase，CPS)、内-贝壳杉烯合成酶(ent-kaurene synthase，KS)催化作用下形成内-贝壳杉烯(ent-kaurene)；在内-贝壳杉烯氧化酶(ent-kaurene oxidase，KO)、内-贝壳杉烯酸氧化酶(ent-kaurenoic acid oxidase，KAO)氧化作用下转化为GA12；之后通过GA20-氧化酶 (GA20-oxidase，GA20ox)、GA2-氧化酶 (GA2-oxidase，GA2ox)等合成具有生物活性的赤霉素[1-3]

GA3是赤霉素应用最为广泛的一种，已有研究表明GA3能够提高作物株高[4]，在多种农作物上的推广应用已产生了巨大的经济效益和社会效益[5-6]。烟草内源激素的水平是影响烟草生长发育的重要因素，喷施外源激素能诱导作物内源赤霉素、脱落酸变化，对植物激素信号转导体系产生影响[7]，从而影响植物对矿质元素的吸收和碳氮的代谢，改变烤烟的生长和烟叶常规化学成分。王林等[8]探究外源激素对中部烟叶品质的影响发现，增施赤霉素及生长素均可改善烤后烟叶理化性质，且浓度越高效果越优。陈富彩[9]通过外源喷施 GA3和生长素(IAA)，发现无论单施还是配施都对烤烟上部叶碳氮代谢产生显著影响，使其还原糖含量增加，烟碱含量降低。

脱落酸合成代谢途径中，玉米黄素在玉米黄素环氧酶(zeathanxinepoxidase，ZEP)两步环氧化作用催化下转变成紫黄素(violaxanthin)，随后紫黄素进一步转化为两种9-顺式-环氧类胡萝卜素(9-cis-epoxy carotenoid)，形式-9-顺式新黄素(9-cis-neoxanthin)或9-顺式-紫黄素(9-cis-violaxanthin)[10]。在9-顺式-环氧类胡萝卜素双加氧酶(enzyme 9-cis-epoxy carotenoid dioxygenase，NCED)的作用下，形成黄氧素(xanthoxin)并从叶绿体(质体)运出到细胞质基质中，进一步形成脱落酸醛(ABA-aldehyde)和最终的脱落酸[11]。

有研究表明，脱落酸位于赤霉素生物合成途径的上游，负调控赤霉素生物合成基因的表达，调节植物生长，脱落酸和赤霉素拮抗调控种子的萌发和休眠，赤霉素可以解除脱落酸对植株地上部生长的抑制[11-12]。秦华等[13]的实验表明，高秆型的水稻品种中内源脱落酸含量低，矮秆型的水稻品种中脱落酸含量高，且水稻的株高和苗高与水稻内的脱落酸含量呈相反的线性关系。

赤霉素和脱落酸作为植物体内的重要植物激素，在植物的生长发育过程中发挥重要作用，赤霉素和脱落酸在生物合成的过程中存在相互作用[14]，有研究表明从种子休眠到萌发过程中，ABA和GA可能作为因果相互影响。精确控制合成ABA和GA含量变化的分子机制尚不清楚，但研究发现部分转录因子起到关键作用，如MYB96、ABI4、CHOTTO1等也参与调控了GA的合成。MYB96转录激活ABA 生物合成过程中的关键基因NCED2和NCED6，同时也抑制GA生物合成基因GA3ox1和GA20ox1的表达。

烟草内源激素的水平是影响烟草生长发育的重要因素，喷施外源激素能诱导作物内源赤霉素、生长素和脱落酸变化[15]，从而对植物激素信号转导体系以及植物对矿质元素吸收和碳氮代谢产生影响，改变烤烟的生长和烟叶常规化学成分。在植物激素信号转导体系中，DELLA蛋白一般被认为是GA3信号途径中一类重要的负调节因子，但越来越多的研究认为其是调节多种激素发挥作用的生长抑制因子[16]。GAI基因是DELLA蛋白重要的控制基因之一，其表达量在植物生长发育过程中受到多种激素如生长素、赤霉素等激素共同调节。围绕外源激素对烟草生长调控及品质影响，前人已开展了一些研究。如周继华[17]在烟草外施一定浓度的GA3能使烟株茎尖内源激素GA与IAA含量提高，显著促进烟草株高与节间距的增长。前人在烟草上对品质研究多于对株高调控研究，且株高研究中激素不同浓度梯度对烟草株高研究较少，而综合研究外源激素对内源激素机理、烤烟生长发育和品质影响得更少。本试验研究苗床期喷施赤霉素(GA3)和脱落酸(ABA)对烤烟品种中烟100和NC71在生长发育期间赤霉素和脱落酸含量的动态变化及相关生理特性变化和烤后烟叶产量和质量的影响，以期为喷施外源生长调节剂提高烤烟产量和品质提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试材料为烤烟品种中烟100和NC71，由河南农业大学烟草学院育种实验室提供。试验于2019年在许昌襄县王洛镇开展，试验地土壤为褐土，选择有代表性、前茬一致、土壤肥力均匀、地面平整、排灌方便、肥力中上等水平的生茬地块。2019年3月1日播种，5月1日移栽，7月10日打顶，其他栽培措施按照当地优质烟叶生产技术规范执行。

5月1日移栽时对准烟草株心喷施赤霉素和脱落酸，喷施时间为17：30-18：30，喷施时液滴要细小、均匀，药液用量以喷施部位湿润为度，为了减少表面张力，在药液中加入20 mL·L-1表面活性剂吐温80，赤霉素浓度为100 mg·L-1，脱落酸的浓度为6 mg·L-1。

1.2 试验设计

试验共设置6个处理，分别为未经喷施赤霉素处理的中烟100(ZY100)、NC71(NC71)，经喷施赤霉素处理的中烟100(ZY100G)、NC71(NC71G)和喷施脱落酸处理的中烟100(ZY100A)、NC71(NC71A)。

1.3 测定项目及方法

1.3.1 内源激素分析测定

于喷施后0、10、20、30、40、50、60、70 d采集各处理中部叶0.5 g 新鲜烟草样品，用液氮速冻后，存放于-80 ℃冰箱中保存，采用间接酶联免疫吸附法 (ELISA)(酶免疫试剂盒由中国农业大学化控中心提供)对赤霉素、脱落酸进行测定。

1.3.2 农艺性状测量

根据《烟草农艺性状调查测量方法》 (YC/T 142-2010)进行烟草农艺性状调查，于喷施后0、10、20、30、40、50、60、70 d测定并记录株高，每个处理选择有代表性的5株。

1.3.3 生理指标测定

叶绿素含量采用95%乙醇浸提比色法进行测定；可溶性蛋白含量采用考马斯亮蓝比色法进行测定；丙二醛含量使用索来宝试剂盒进行测定。

1.3.4 常规化学成分测定

根据《烟草及烟草制品 总植物碱的测定 连续流动法》 (YC/T 468-2021)、《烟草及烟草制品 水溶性糖的测定 连续流动法》 (YC/T 159-2019)、《烟草及烟草制品 钾的测定 连续流动法》(YC/T 217-2007)和《烟草及烟草制品 氯的测定 连续流动法》(YC/T 162-2011)标准测定烟叶烟碱、总糖、钾和氯含量。钾氯比为钾含量除以氯含量。

1.3.5 经济性状统计

根据《烤烟》(GB 2635-1992)对烤后烟叶分级，统计各处理产量，以2019年当地的烟叶收购价格计算产值，统计各处理各等级烟叶比例。

1.3.6 烟草叶片总RNA的提取

RNA提取：采用Plant RNA isolation Aid提取参试材料叶片总RNA，将提取的RNA加入适量DEPC水溶解，于-80 ℃保存。逆转录：利用HiScript Ⅱ Q RT SuperMix for qPCR(+gDNA wiper)(Vazyme，R223-01)将待测RNA逆转录成cDNA，逆转录完毕后加入90 μL Nuclease-free H2O储存在-20 ℃冰箱备用。引物设计：引物采用Roche LCPDS2软件设计(表1)，并由上海捷瑞生物工程有限公司合成。荧光定量PCR：利用ChamQ SYBR qPCR Master Mix试剂盒(Q311-03，Vazyme)在LightCycler® 480 Ⅱ型荧光定量PCR仪(Roche，Swiss)上进行反应。体系：2×ChamQ SYBR qPCR Master Mix，5 μL；10 μmol·L-1Forward primer，0.2 μL；10 μmol·L-1Reverse primer，0.2 μL；cDNA，1 μL；Nuclease-free H2O，3.6 μL。PCR程序：95 ℃ 30 s；95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，40个循环。循环结束后利用熔解曲线检测产物特异性：从60 ℃缓慢升温至97 ℃，每摄氏度采集5次荧光信号。依据CT值，计算相对表达量并作图。

表1 荧光定量引物序列Table 1 Fluorescence quantitative primer sequences

1.4 数据处理

使用DPS 7.05软件，采用Duncan新复极差法比较不同处理间各种指标之间的差异；使用Origin Pro 8.5进行相关数据统计分析。

2 结果与分析

2.1 不同外源GA3和ABA处理对烤烟株高的影响

如图1所示，喷施赤霉素前10 d各处理间株高差异不显著，20 d和30 d NC71株高显著低于其他处理，40～70 d株高出现差异，其中ZY100G显著高于其他处理，70 d时株高为113.24 cm，相比对照(ZY100)升高20%，NC71G相对于NC71升高31%，ZY100、NC71在70 d时株高分别为105.73、80.66 cm。在先喷赤霉素再喷脱落酸处理后，40～70 d ZY100A低于ZY100，NC71A低于NC71。说明喷施赤霉素后能显著增加株高，且处理后的NC71株高与未处理的中烟100相近，而喷施脱落酸能够抑制赤霉素对烟株株高的促进作用。

同时期不同处理柱上无相同小写字母表示差异显著(P<0.05)。图2、4～6同。图1 不同处理对烤烟株高的影响Fig.1 Effect of different treatments on the plant height of flue-cured tobacco

2.2 不同外源GA3和ABA处理对烤烟内源激素的影响

根据图2中A可知，喷施赤霉素的NC71G、ZY100G较未喷施赤霉素的NC71、ZY100的内源赤霉素显著增加，先喷赤霉素再喷脱落酸后NC71A、ZY100A较喷施赤霉素的NC71G、ZY100G内源赤霉素显著减少。NC71G在处理20 d后内源赤霉素含量比NC71升高30%，表明苗期喷施赤霉素有助于增加植株内源赤霉素的含量，而喷施脱落酸会抑制植株内源赤霉素的含量，并且品种间对外源赤霉素的响应快慢存在差异。

图2 不同处理对烤烟内源激素含量的影响Fig.2 Effect of different treatments on the content of endogenous hormones in flue-cured tobacco

根据图2中B可知，6个处理脱落酸含量随时间逐渐升高，前30 d差异不显著，处理后40 d时ZY100A脱落酸含量高于ZY100G，60 d以后喷施赤霉素的NC71G、ZY100G较未喷施赤霉素的NC71、ZY100内源脱落酸显著减少，表明苗期喷施赤霉素在还苗期、旺长期对脱落酸影响较小，在成熟期影响较大。并且喷施外源脱落酸后可以提高内源脱落酸的含量。

根据图2中C可知，处理后10～50 d，喷施赤霉素的NC71G、ZY100G较未喷施赤霉素的NC71、ZY100赤霉素与脱落酸的比值均显著增加，未喷施赤霉素的NC71、ZY100较喷施脱落酸的NC71A、ZY100A的赤霉素与脱落酸的比值均显著增加。

2.3 不同外源GA3和ABA处理对内源激素相关基因表达的影响

根据图3可知，喷施外源赤霉素后CPS、GA20ox和PSY的基因表达量均上调，GA2ox基因表达量下调。在ZY100中CPS和PSY的表达量与对照无显著差异，GA20ox和GA2ox的基因表达量均与对照有显著差异。在NC71中除PSY的基因表达量与对照无显著差异外，其他基因在喷施赤霉素后均与对照有极显著差异，在喷施脱落酸对各基因表达量的影响与喷施赤霉素处理呈现明显的相反作用。

“*”和“**”分别表示同一基因不同处理在0.05和0.01水平差异显著。图3 不同处理对烤烟赤霉素和脱落酸相关基因表达量的影响Fig.3 Effect of different treatments on the expression of gibberellin and abscisic acid related genes in flue-cured tobacco

2.4 不同外源GA3和ABA处理对烤烟生理特性的影响

2.4.1 不同外源GA3和ABA处理对叶绿素含量的影响

如图4所示，喷施后前10 d各处理间叶绿素含量差异不显著，从30 d开始喷施赤霉素的处理叶绿素含量显著高于同品种未喷施的处理。其中，NC71A叶绿素含量显著低于其他处理，ZY100G显著高于其他处理，说明喷施赤霉素后叶片叶绿素含量显著增高，且处理后的NC71叶绿素含量与未处理的中烟100相近，喷施脱落酸会降低外源赤霉素对叶片叶绿素含量的影响。

图4 不同处理对烤烟叶绿素含量的影响Fig.4 Effect of different treatments on chlorophyll content in flue-cured tobacco

2.4.2 不同外源GA3和ABA处理对丙二醛的影响

根据图5可知，喷施后前10 d经喷施处理后同品种间丙二醛含量差异不显著，20 d和30 d ZY100G丙二醛含量显著低于其他处理，40 d开始喷施赤霉素处理的丙二醛含量显著低于同品种未喷施处理，喷施脱落酸处理的丙二醛含量显著高于对照，其中，ZY100G丙二醛含量显著低于其他处理，NC71A显著高于其他处理，说明喷施赤霉素后叶片丙二醛含量显著降低，处理后的NC71丙二醛含量与未处理的中烟100相近，且喷施脱落酸后丙二醛的含量显著升高。

图5 不同处理对烤烟丙二醛含量的影响Fig.5 Effect of different treatments on the content of malondialdehyde in flue-cured tobacco

2.4.3 不同外源GA3和ABA处理对可溶性蛋白的影响

根据图6可知，喷施后前20 d各处理间可溶性蛋白含量差异不显著，喷施赤霉素后30 d和40 d的相同品种间可溶性蛋白含量差异不显著，但含量高于未喷施处理，喷施脱落酸后各品种可溶性蛋白含量显著降低，50 d开始喷施赤霉素处理的可溶性蛋白含量显著高于同品种未喷施的处理。其中，NC71A可溶性蛋白含量显著低于其他处理，ZY100G显著高于其他处理，说明喷施赤霉素后叶片可溶性蛋白含量显著提高，处理后的NC71可溶性蛋白含量与未处理的中烟100相近，喷施脱落酸后叶片中可溶性蛋白的含量显著降低。

图6 不同处理对烤烟可溶性蛋白含量的影响Fig.6 Effect of different treatments on the content of soluble protein in flue-cured tobacco

2.5 不同外源GA3和ABA处理对烤后烟叶常规化学成分的影响

根据表2可知，喷施外源赤霉素后中烟100和NC71的烤后烟叶总糖含量、钾含量、钾氯比均有所增加，其中喷施外源赤霉素后中烟100和NC71的总糖含量显著增加，而烟碱含量和氯含量均显著下降，喷施外源脱落酸与喷施外源赤霉素的结果截然相反。

表2 不同处理对烤后烟叶常规化学成分的影响Table 2 Effects of different treatments on the conventional chemical components of flue-cured tobacco leaves

2.6 不同外源GA3和ABA处理对经济性状的影响

根据表3可知，喷施外源赤霉素后烤烟各经济性状表现较好，各指标显著上升，以ZY100G最优，其次是NC71G和ZY100，两者各性状差异不显著，而喷施脱落酸后两个品种的经济性状最差。

表3 不同处理对烤烟经济性状的影响Table 3 Effects of different treatments on economic characters of flue-cured tobacco

3 结论与讨论

3.1 讨论

试验结果表明，在对株高的影响上，经过外源赤霉素处理的ZY100的株高显著高于其他3个处理，经过外源脱落酸处理的NC71A的株高最低，未经处理的ZY100与经过外源赤霉素处理的NC71两组的株高接近。NC71G的株高也显著高于NC71，喷施脱落酸处理的NC71A、中烟100A株高均显著低于对照。说明100 mg·L-1的外源赤霉素喷施可以增加烟株株高[18]，6 mg·L-1的外源脱落酸喷施可以降低烟株的株高，脱落酸与赤霉素之间存在明显的拮抗作用。

在对叶绿素含量和可溶性蛋白含量的影响上，经过外源赤霉素处理的ZY100的叶绿素含量和可溶性蛋白含量最高，经过脱落酸处理的NC71A含量最低，未经处理的ZY100与经过外源赤霉素处理的NC71含量接近，经过外源赤霉素处理的NC71显著高于未经外源赤霉素处理的NC71，说明100 mg·L-1的外源赤霉素与烟草叶片叶绿素和可溶性蛋白含量呈正相关[19]，对烟株的生长发育有着积极的作用，6 mg·L-1的外源脱落酸与叶片叶绿素和可溶性蛋白含量呈负相关，对烟株的生长发育存在抑制作用，与赤霉素相互拮抗。

在对丙二醛含量的影响上，经过外源赤霉素处理的ZY100的丙二醛含量最低，而经过脱落酸处理的NC71A的丙二醛含量最高，未经外源赤霉素处理的ZY100与经过外源赤霉素处理的NC71含量接近，经过外源赤霉素处理的NC71的丙二醛含量显著高于未经处理的NC71。因为丙二醛反映的是细胞膜的损伤程度，其含量越高烟草叶片受损就越严重。根据试验结果可知，100 mg·L-1的外源赤霉素可以有效降低烟草叶片丙二醛含量[20]，从而保证烟草叶片的发育，对烟草的生长发育有着积极的作用，且赤霉素和脱落酸之间存在明显的拮抗作用。

在对内源赤霉素含量的影响上，经过100 mg·L-1的外源赤霉素处理的ZY100G与NC71G的内源赤霉素含量显著高于未经过处理的ZY100与NC71，且ZY100G显著高于其他处理组，NC71G在20 d后显著高于NC71，而经脱落酸处理的NC71A、中烟100A的内源赤霉素含量最低，表明在苗床期喷施100 mg·L-1的外源赤霉素可以有效增加烟草叶片内源赤霉素的含量[21]，并且该含量的增加在不同的品种间存在差异，且喷施赤霉素和喷施脱落酸在影响植株株高以及内源化学物质方面存在明显的拮抗作用[22]。

3.2 结论

赤霉素是植物幼苗发育常用的生长调节剂，调控植物生长发育整个过程，脱落酸是植物体内与赤霉素存在拮抗作用的植物激素。本研究通过对中烟100和NC71苗床期喷施100 mg·L-1外源赤霉素(GA3)和6 mg·L-1外源脱落酸(ABA)的研究中发现，喷施外源赤霉素可以改善烟草叶绿素、可溶性蛋白、丙二醛和内源赤霉素的含量，从而增强烟株的光合作用，加强其对营养物质的吸收和干物质的积累；提高细胞的保水能力，降低膜质的过氧化程度，减少细胞的受损程度，喷施外源脱落酸后抑制了内源赤霉素的含量，提高了内源脱落酸的含量，表明脱落酸和赤霉素在烟株生长发育和内源激素方面存在明显的拮抗作用，同时喷施外源赤霉素使烤后烟叶化学成分更加协调从而提高烟叶品质，并且可以提高经济产量。综上所述，可在烟草种植苗期喷施适宜浓度的赤霉素来提高烟草的品质和产量，提高烟草农业综合生产能力。