间歇性缺氧大鼠早期动脉粥样硬化中血管生成性T淋巴细胞的表达变化

孙建宇，郭 华，张云云，崔小川

南京医科大学附属无锡人民医院全科医学科，江苏 无锡 214023

阻塞性睡眠呼吸暂停低通气综合征（obstructive sleep apnea hypopnea syndrome，OSAHS）是动脉粥样硬化性疾病的独立危险因素，在动脉粥样硬化性心脏病患者中的发生率高达40%～80%［1］。慢性间歇性缺氧（chronic intermittent hypoxia，CIH）是OSAHS重要的病理生理学特征［2］，引起血液循环中氧合水平出现周期性变化，引发脂质代谢紊乱、氧化应激和免疫炎症改变，并通过其相互作用，最终导致动脉粥样硬化的发生。

动脉粥样硬化的起始改变是内皮损伤和功能障碍，随后受损组织分泌一系列促血管生成因子趋化成血管细胞至损伤部位修复内皮损伤以及形成新生血管［3］。血管生成性T 淋巴细胞（angiogenic T lymphocyte，Tang）是T 淋巴细胞亚群之一，也是一类成血管细胞，其主要细胞表面标志物包括CD3、CD31、CXCR4，通常被标记为CD3+CD31+T 淋巴细胞。研究表明，Tang 可通过分泌促血管生成因子白细胞介素-8（interleukin-8，IL-8）、基质金属蛋白酶-9（matrix metalloproteinases-9，MMP-9）和粒细胞集落刺激因子（granulocyte-colony stimulating factor，G-CSF）促进内皮祖细胞（endothelial progenitor cell，EPC）增殖、分化，参与损伤血管内皮修复或新生血管形成［4］。Weil 等［5］研究发现，心脑血管疾病患者外周血中Tang 水平降低。迄今尚未有CIH 暴露下Tang 对早期动脉粥样硬化发生发展影响的相关性研究。

本研究拟通过建立CIH 大鼠动脉内皮损伤模型，观察CIH暴露下大鼠血管病变及外周血Tang表达水平的变化，为进一步寻求OSAHS相关性动脉粥样硬化性疾病的干预及治疗策略提供线索。

1 材料和方法

1.1 材料

16 只成年雄性健康Sprague Dawley（SD）大鼠（体重210～230 g）购买于常州卡文斯实验动物有限公司。实验于南京医科大学附属无锡人民医院实验动物中心进行。实验过程严格按照《实验动物的饲养和使用指南（第八版）》要求执行。此实验获得南京医科大学附属无锡人民医院动物保护伦理委员会的批准（实验伦理号：220214501）。

FITC 荧光Anti-CD3 抗体、FITC 荧光Anti-CD31抗体、FITC 荧光Anti-CD34 抗体（Santa Cruz 公司，美国），CD133 抗体（Abcam 公司，美国），FITC 标记山羊抗兔IgG（Biosharp 公司，北京），高密度脂蛋 白胆固醇（high-density lipoprotein cholesterol，HDL-C）、低密度脂蛋白胆固醇（low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C）、甘油三酯（triglycerides，TG）、总胆固醇（total cholesterol，TC）、同型半胱氨酸（homocysteine，Hcy）酶联免疫试剂盒（上海酶联生物）。

1.2 方法

1.2.1 实验分组及CIH大鼠模型制备

16只SD大鼠标号称重后随机分为2组：正常饲养组（RA组）和间歇性缺氧组（IH组），每组8只。饲养条件为：每4只大鼠饲养在1个鼠笼中，大鼠可自由取食足够的灭菌饲料及干净饮用水，室温保持在20～24 ℃，室内保持相对安静，噪音小于50 dB，室内照明12 h 调整1 次，保持通风换气。因自然界中大鼠习性为昼伏夜出，本实验在大鼠白天睡眠时将IH 组大鼠放入CIH 仓（无锡市怀信生物公司）进行间歇性缺氧实验8 h，其余时间则放回正常动物房内，与RA组大鼠在相同环境下饲养。每日上午8点将IH 组大鼠置于CIH 仓中，在电脑控制仪上将循环模式设置为：每2 min 1 个循环，40 s 内氧气浓度降到8%之后稳定20 s，然后氧气浓度在40 s 内恢复到21%之后维持20 s。将CIH 仓内氧气浓度维持在8%时，经大鼠耳朵测量其血氧饱和度，能够降低至80%以下，可以模拟重度OSAHS 患者夜间呼吸暂停时的缺氧情况，且2 min 循环1 次的模式，达到了睡眠呼吸暂停低通气指数≥30 次的重度OSAHS 诊断标准。IH 组大鼠每日循环8 h 后取出，置于正常空气环境下饲养，连续间歇性缺氧6周，共42 d。

1.2.2 大鼠胸主动脉HE染色

使用3%戊巴比妥钠（30 mg/kg）对大鼠进行腹腔注射麻醉，进行心脏穿刺取血，每只大鼠取约5 mL 全血，置于4 ℃冰箱内待下一步检测；开胸将大鼠胸主动脉剥离，截取胸主动脉，分离好的组织用预冷的PBS 将表面冲洗干净，固定、脱水、透明、渗透、包埋、切片、脱蜡、复水、染色后用中性树胶封存。在光镜下观察大鼠胸主动脉的病理改变，并测量平均动脉内中膜厚度（intima-media thickness，IMT）。

1.2.3 HDL-C、LDL-C、TG、TC、Hcy水平检测

取大鼠全血3 000 r/min 离心15 min，分离血清后，通过ELISA法检测HDL-C、LDL-C、TC、TG及Hcy。

1.2.4 流式细胞术检测

取大鼠全血裂红后进行流式双标检测Tang 及EPC 占单个核细胞（mononuclear cell，MNC）比例，检测指标分别为CD3+CD31+和CD34+CD133+。调整细胞悬液浓度至1×106个/mL，取样本1 mL分别加入1 μg未稀释CD3、CD31 抗体置于4 ℃孵育30 min，加入1 mL PBS 上机检测Tang 水平；另外，再取1×106个/mL 的细胞样本1 mL加入1 μg CD34抗体，4 ℃孵育30 min，然后加入1 μg 未稀释CD133 抗 体4 ℃孵育1 h，因本实验所用CD133 抗体非荧光抗体，故再加入1 μg CD133相对应的二抗（FITC标记山羊抗兔IgG）4 ℃孵育30 min，随后加入1 mL PBS上机检测。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 CIH大鼠胸主动脉内中膜增厚

经过6 周的间歇性缺氧暴露后，取大鼠胸主动脉切片做HE 染色，IH 组病理切片中未见动脉斑块及脂质空泡（图1A），胸主动脉内中膜厚度IH组［（121.275±30.896）μm］对比RA 组［（84.075±7.452）μm］显著增厚（P<0.01，图1B）。

图1 间歇性缺氧暴露可导致大鼠胸主动脉内中膜增厚Figure 1 Intermittent hypoxia exposure caused a thickening of thoracic aorta IMT in rats

2.2 CIH大鼠Hcy、TC、TG、HDL-C、LDL-C水平改变

使用ELISA 方法测定大鼠血清中Hcy、TC、TG、HDL-C、LDL-C水平。IH组比RA组Hcy水平显著升高（P<0.05，图2A）。TG、HDL-C、LDL-C、TC 水平，IH 组对比RA 组差异均无统计学意义（P>0.05，图2B～E）。

图2 RA组与IH组大鼠Hcy、TC、TG、HDL-C、LDL-C的水平Figure 2 Levels of Hcy，TC，TG，HDL-C，and LDL-C in rats in the RA and IH groups

2.3 CIH大鼠Tang水平显著升高

与RA 组相比，IH 组Tang/MNC 比值增高［（22.975±1.866）%vs.（15.713±1.746）%］，差异具有统计学意义（P<0.001，图3A、B）；IH组EPC/MNC的比值增高［（0.040±0.028）%vs.（0.028±0.012）%］，但差异无统计学意义（P>0.05，图3C、D）。

图3 RA组与IH组大鼠Tang及EPC水平Figure 3 Levels of Tang and EPC in rats from the RA and IH groups

3 讨论

作为动脉粥样硬化的独立危险因素，长期CIH暴露会导致动脉粥样硬化斑块的产生［6］。动脉粥样硬化病变通常是从动脉内膜开始，经过脂质和复合糖类沉积、内皮损伤及血小板聚集、血栓形成，进而成纤维细胞增生及钙质沉着，并伴有动脉内中膜的重构和钙化，导致动脉壁增厚变硬、血管腔狭窄［7］。Cuspidi 等［8］研究发现，动脉粥样硬化斑块和管腔狭窄反映的是动脉粥样硬化过程的更晚期阶段，而在动脉粥样硬化早期阶段，血管内皮损伤后，血管发生适应性重构导致的IMT增厚应是更重要标志。有研究证实，中重度OSAHS患者颈动脉内中膜厚度与缺氧程度成正比，CIH能够导致Hcy显著升高，造成血管内皮损伤，并导致血脂代谢异常［9］。而本研究在进行动脉内皮损伤大鼠造模过程中发现，在IH组大鼠中并未观察到血清HDL-C、LDL-C、TG、TC显著变化，但发现IH组相比RA组，血清Hcy水平显著升高且胸主动脉IMT显著增厚，而IH组大鼠胸主动脉病理切片血管壁完整、未见动脉斑块及脂质空泡，证实CIH暴露6周的大鼠动脉为应对血管内皮损伤发生了内膜适应性重构，处于动脉粥样硬化的早期阶段。

循环EPC 水平是血管内皮损伤与修复平衡的衡量标准之一，在具有各种心血管疾病危险因素如高血压、肥胖、血脂异常、糖尿病等疾病的患者中会降低［3］。本研究检测了造模后大鼠循环Tang及EPC水平，发现IH组大鼠Tang水平显著升高，IH组大鼠EPC 虽表达升高，但与RA 组大鼠EPC 水平比较无统计学差异。有文献报道，Tang 可促进EPC 增殖，维持循环中EPC的水平［4］。由此推测，在大鼠动脉粥样硬化早期阶段，可能由于IH 组大鼠Tang 水平显著升高，保证了循环中EPC 的水平，进而有效维持了血管损伤与修复的平衡。

此外，Tang 表面表达CXCR4 受体，CXCR4 是稳态趋化因子基质细胞衍生因子-1α（stromal cell derived factor-1，SDF-1α）的特异性受体，Tang 向外周血中的趋化反应受到SDF-1α的调节。研究表明，SDF-lα的上游调控因子是缺氧诱导因子-1（hypoxia inducible factor-1，HIF-1），在缺氧条件下HIF-1进入细胞核与靶基因的缺氧反应应答元件结合，上调SDF-1α的表达并释放入血［10］。因此推测CIH 暴露后，缺氧诱导HIF-1/SDF-1α/CRCX4 信号轴激活，细胞内HIF-1水平升高，上调SDF-1α表达并释放入外周血中，趋化更多的Tang 进入循环，这可能是本研究观察到Tang水平升高的原因，是值得进一步研究的方向。

本研究尚存在不足，未能探讨Tang细胞水平改变对动脉粥样硬化的具体作用及其机制。

综上所述，本研究发现，在间歇性缺氧暴露下，大鼠循环Tang 水平升高可能参与血管早期发生适应性重构改变过程，与早期动脉粥样硬化有关。本研究为OSAHS 相关性动脉粥样硬化性疾病的干预及治疗策略提供线索。