间充质干细胞联合细胞支架治疗卵巢早衰的研究进展*

胡伍清,毕慧玲,苗聪秀

(长治医学院附属和平医院生殖遗传科,山西省卫生健康委员会生殖工程重点实验室,长治 046000)

1 卵巢早衰(premature ovarian failure,POF)

1.1 POF病因学 卵巢功能下降包括卵巢储备功能减退、早发性卵巢功能不全及POF三个不同阶段,这是一个逐渐进展的过程。POF是早发性卵巢功能不全的终末阶段,其临床表现为月经稀发、经量减少甚至闭经、雌激素水平下降、FSH升高、不孕不育等。POF病因可能包括遗传因素和医源性因素,遗传因素:染色体及相关基因异常,如BMP15、BMPR1A/1B、PGRMC1、FSHR、CYP11、FOXL2、GDF9、MCM8等;医源性因素:放化疗、盆腹腔手术以及自身免疫性因素等[1-2]。因其病因复杂,许多未知的因素仍在进一步探索中。有研究证明,DNA损伤反应(DNA damage response,DDR)是调控生殖衰老的主要生物途径,DDR存在于整个生命过程中,调控卵巢储备及其耗竭,尤其是关键基因的功能丧失或变异。该研究发现,FMR1异常是引起POF的主要单基因病因,这为揭开POF的本质向前迈进了一大步[3]。

1.2 POF的治疗 POF的治疗方法包括:激素替代疗法(hormone replacement therapy,HRT)、体外激活疗法(in vitro activation,IVA)、赠卵体外受精胚胎移植(in vitro fertilization with oocyte donation,IVF-OD)、干细胞治疗等。HRT是治疗POF的推荐方法[4-5]。但有研究表明,长期HRT会增加患者患子宫内膜癌、静脉血栓栓塞的风险,同时无法从根本上逆转卵巢功能减退[6-7]。卵巢储备减少的部分POF患者,可通过IVA方法获得成熟的卵母细胞进行体外受精胚胎移植(in vitro fertilization and embryo transfer,IVF-ET),然而IVA需要有一定数量的卵巢卵泡储备,而且影响其临床应用的最大问题是效率极低问题,不是所有的POF患者都适用此方法,且不能改变与年龄相关的卵母细胞质量下降[8]。IVF-OD利用捐献的卵子进行IVF-ET,是治疗POF患者不孕的方法之一,但IVF-OD治疗无法使患者拥有与自身基因相同的后代,且研究表明通过IVF-OD获得的妊娠,妊娠期高血压疾病、子痫前期、胎儿出生体重不足和早产等的风险增加[9]。干细胞技术一直以来被视为“再生医学技术”,可促进组织修复与再生,被认为是未来治疗POF的最有效方法[10]。

2 间充质干细胞(mesenchyal stem cells,MSCs)

2.1 间充质干细胞特性 干细胞是一类未分化的细胞或原始细胞,在特定条件下可激发其分化潜能,定向分化为组织或器官,具有极强的组织修复潜能。干细胞治疗技术被誉为继药物治疗和手术治疗之后的第三次医学革命,是近年来国际医学前沿重点发展领域[11]。MSCs是中胚层来源的一类多能型干细胞,是干细胞家族的重要成员,MSCs除了具有多项分化潜能外,还具有自发趋向损伤组织、促进局部组织血管生成,调节周围细胞微环境以及免疫调节功能[12-13]。它们可从人体许多不同组织中,如骨髓、脐带、外周血、脂肪组织、胎盘和经血中分离培养获得,可实现体外建系、扩增,同时MSCs不表达或仅表达极低水平的主要组织相容性复合物和T细胞共刺激因子从而表现出低免疫原性,解决了异体细胞治疗最主要的免疫排斥问题[14]。MSCs可提供一个必要的微环境,以促进卵泡发育[15]。因此,MSCs治疗有望成为许多难治性疾病,如克罗恩病、移植抗宿主病、POF等最有前景的治疗方法,且已初见成效[16-17]。一项I期临床试验中对9例POF患者进行了MSCs治疗,在研究期间和随后长达12个月的随访中,根据患者体格检查、相关实验室指标和超声检查评估患者术后状态,均未观察到全身或局部不良反应,进一步验证了其治疗的安全性[18]。

2.2 MSCs归巢 MSCs的疗效取决于MSCs归巢效率,MSCs归巢受植入方式、组织释放的选择素、细胞趋化因子(如SDF-1、MCP-1、MCP-3)、生长因子等MSCs表达的受体类型(如CD44、CD24、CCR2)以及分泌的整合素的综合影响,只有一小部分MSCs能到达并停留于目标组织[19]。研究证明,静脉注射MSCs制剂时大多数MSCs被滞留在毛细血管组织中无法迁移到损伤部位[20];或在到达目标组织之前被脾巨噬细胞吞噬清除而影响治疗效果[21]。细胞支架可为MSCs提供适合的3D空间,并确保MSCs最大限度迁移到靶组织。因此,间充质干细胞联合细胞支架成为治疗POF的研究热点[22]。

3 组织工程学(tissue engineering,TE)与细胞支架

3.1 细胞支架 TE是一门应用生命科学、材料学和工程学,帮助受损组织重建,恢复其生理结构和功能的新兴学科,主要由种子细胞、支架和生物活性物质三个重要部分构成。一个理想的支架除了无毒无害的基本要求之外,还应给细胞提供足够的三维生长空间,同时促进细胞生长、增殖、参与信号传递,且在愈合过程中或之后逐渐被人体吸收[23]。在支架制造选材中,细胞外基质(extracellular matrix,ECM)因具有较高的生物相容性、生物降解性以及在体内快速重塑的可能性成为制造细胞支架较为理想的材料[24]。ECM主要由蛋白质包括胶原蛋白、纤维蛋白、弹性蛋白等,以及多糖,包括海藻酸盐、透明质酸(hualuronic acid,HA)、壳聚糖(chitosan,CS)等组成。这些物质为周围细胞提供机械支持,同时协调多种细胞信号传递,在组织中的细胞之间发挥通信联络作用并参与组织修复[25]。在组织工程中这些天然聚合物可制作成水凝胶的形式包裹细胞,为细胞提供适合的生长空间[26]。

3.2 各类支架 临床上常用的几种细胞支架包括胶原蛋白支架、纤维蛋白支架、CS支架、海藻酸盐支架等。

3.2.1 胶原蛋白支架 胶原蛋白是动物组织中最丰富的可利用的蛋白质,具有抗原性低、生物相容性好、生物降解性高等特点,在TE中得到广泛应用[27]。胶原蛋白支架可支持多种组织和细胞类型,并为细胞锚定、迁移和移植提供合适的位置。Jing等[28]研究发现,脂肪间充质干细胞(adipose-derived stem cells,ADSCs)与胶原蛋白支架共培养会增加ADSCs中FGF2、VEGF、TGFb1和HGF的表达。同时胶原蛋白支架也会与ADSCs相互作用,形成三维微环境,使ADSCs存活率增加,并在卵巢周围聚集,分泌更多的生长因子、血管内皮生成因子,最终增加卵泡颗粒细胞和血管的生成。然而胶原蛋白支架的缺点是机械强度低,降解过快,影响细胞在组织的停留时间,这会影响到该支架在临床应用中的治疗效果。

3.2.2 纤维蛋白支架 纤维蛋白在生物体内普遍存在,可对血管生成和成纤维细胞生长起到积极作用,有极强的黏附性能,免疫原性较低,易塑形,可制备成具有复杂几何形状的支架,因此纤维蛋白也成为构造细胞支架材料的不二之选,尤其在体外组织器官的重建中具有很大的潜力[29]。在一项小鼠自体卵泡移植实验中,用纤维蛋白支架作为载体携带血小板裂解物包裹卵泡后进行移植,取得了较好的效果[30]。但纤维蛋白支架的缺点是需要多种聚合物进行聚合反应,纤维蛋白原浓度、凝血酶浓度和离子强度的变化都会影响纤维蛋白支架的性能,导致支架外观、机械性能和稳定性发生不同程度变化。

3.2.3 CS支架 CS是甲壳素N-脱乙酰基的产物,主要来源于甲壳类动物的外壳,CS降解后产生的氨基酸,对人体无害且可被完全吸收。CS来源丰富且具有极好的弹性、柔韧性、可生物降解、良好的生物相容性、无毒、亲水、抗菌和促进伤口愈合等特性,使其在生物材料中占据了独特的地位[31]。但CS的制备和降解需要一定范围的PH,且机械性能较弱,难以维持一定的形状,这也在一定程度上限制了其应用。

3.2.4 海藻酸盐支架 海藻酸盐是一种主要存在于海洋藻类细胞壁和细胞黏胶质中的亲水性多糖,水合反应后呈凝胶状[32]。海藻酸盐作为一种多用途聚合物,具有资源丰富、生物相容性好、处理简单、凝胶性质温和且经济实惠等优点。以海藻酸盐为基础的水凝胶和支架在生物活性制剂的控释系统、癌症治疗和抗菌剂等多个领域已进行了广泛的研究[33]。尽管如此,海藻酸盐支架同样表现出机械性能弱和不易控制其形态的缺点。

3.2.5 HA细胞支架 HA是构成ECM的多糖类物质,在许多生理过程中起着关键作用,如调节血管壁的通透性,蛋白质、电解质扩散及运转,细胞黏附、迁移和增殖等,并在医学的眼科、骨科、皮肤科、心血管科及神经科等学科有着广泛的研究应用[34]。HA具有不错的黏弹性和一定的生理调节功能,在TE中一直受到科学家们的青睐。HA细胞支架已被证实可在一定程度上延长MSCs在卵巢组织的停留时间,进而增强其旁分泌功能[35]。同时也由于HA的生物学特性导致其在体内植入后较其他种类支架更易被机体吸收。由于单一材料的支架各有其局限性,通过结合不同材料的优点来提高细胞支架的理化和生物性能的新型复合材料也在不断的研发中[36]。

4 MSCs与细胞支架及在POF的研究应用

4.1 MSCs/细胞支架与卵泡体外培养 卵巢作为调节女性内分泌及生殖功能的性腺,内含许多始基卵泡,经逐步生长发育,从始基卵泡发育成为次级卵母细胞从卵巢内排出。在月经周期中发育的众多卵泡里,只有一个优势卵泡可发育成熟,因此女性一生中约有400～500个卵泡可完全发育成熟而排卵,卵巢中留存的卵泡数量和质量反应了卵巢储备功能。POF患者往往伴有不同程度的卵泡数量减少和(或)质量下降,卵巢储备功能的变化是评价POF疗效的重要参考指标之一。体外卵泡培养有望成为一种获得成熟卵母细胞用于受精的有效方法[37],也为将来用于改善POF患者卵巢功能,保存生育能力带来希望[38]。Rajabi等对卵泡体外培养方法的优化进行了一系列的研究,分别制备好0.25%海藻酸钠和0.75%的胶原蛋白凝胶支架,用于卵泡和人经血间充质干细胞(human menstrual blood mesenchymal stem cells,MenSCs)体外三维共培养,连续观察12d后分析结果。该实验结果表明海藻酸钠支架共培养组比胶原蛋白共培养组卵泡存活率更高,且激素测定发现卵泡的雌二醇和孕酮的分泌量显著增加,但两组之间无明显统计学差异,并且该研究还发现MenSCs下调了卵泡Mater基因的表达,明显上调Gdf9和Bmp15表达,而海藻酸盐支架和胶原蛋白支架对卵泡的基因表达无影响[39]。虽然海藻酸盐支架在卵泡体外培养具有一定的优势,但有研究认为,从海藻酸盐支架共培养系统获得的卵母细胞发育能力较低,减数分裂纺锤体组装可能受到干扰。Hassani等[40]进行了卵泡体外培养的相关研究,指出与0.5%、1.5%浓度的CS支架相比,1%浓度的CS支架孔隙分布更均匀,降解率高,化学性质稳定,且机械性能强,最适合供给卵泡细胞体外三维培养。1%浓度CS支架组与0.7%浓度海藻酸盐支架组比较,采用酶联免疫吸附试验检测CS和海藻酸盐各组中卵泡形态、成熟卵母细胞质量和类固醇激素分泌情况,用实时荧光定量PCR法检测卵泡发生、内分泌和凋亡相关基因的表达,结果表明1%CS支架组的卵泡成活率、卵泡直径、雌二醇分泌、Cyp19a1、Lhcgr基因表达均高于0.7%海藻酸盐支架组,且海藻酸盐支架组卵母细胞纺锤体紊乱的比例(42.1%)显著高于1%CS支架组(16.6%)。因此,Hassani等认为1%CS支架相比0.7%海藻酸盐支架更适用于卵泡的体外三维培养。

4.2 MSCs/细胞支架与卵巢组织移植 POF病因复杂,癌症患者放化疗过程中可导致卵泡凋亡引起POF。有POF风险且有生育要求的癌症患者,可通过胚胎冻存、卵母细胞冻存和卵巢组织冻存等,或进行卵巢原位干细胞治疗来保留其生育功能。然而卵巢组织在移植后会有大量卵泡凋亡,移植过程仍有许多问题需解决。为了提高卵巢组织移植后卵泡的存活率,Dolmans等将ADSCs嵌入纤维蛋白支架中并移植到免疫缺陷小鼠的腹膜壁下部的1/3处,然后将卵巢组织移植到细胞支架,移植后第3、7和14d对种植体中的PO2进行监测和分析。结果表明,通过与ADSCs/纤维蛋白支架的结合,移植组织在早期获得了更高的血氧水平,组织血管生成增加,卵泡存活率升高[41]。

4.3 MSCs/细胞支架原位注射疗法 MSCs原位注射疗法,更易被接受,操作简单,更有望应用于POF的临床治疗中。动物实验研究表明,MSCs治疗能改善卵巢功能并提高生育能力。Ding等[42]研究发现,胶原支架/脐带间充质干细胞(umbilical cord-derived mesenchymal stem cells,UC-MSCss)通过磷酸化FOXO3a和FOXO1促进小鼠原始卵泡激活,并抑制卵泡凋亡。随后的临床试验中,招募14例POF患者,将UC-MSCs或胶原支架/UC-MSCs移植到卵巢中,3个月后超声检查卵巢的体积和血流量来评估卵巢恢复情况。与移植前相比,移植后卵巢体积增加,且卵巢中未见间质增生及其他卵巢异常结构。3个UC-MSCs组的病例和3个胶原支架/UC-MSCs组的病例超声显示卵巢可见明显血流信号(62.5%,5/8)胶原支架/UC-MSCs组患者移植后卵泡增生,胶原支架/UC-MSCs组中的1例和UC-MSCs组中的1例在接受移植后的一年内成功妊娠。一项UC-MSCss联合HA治疗POF模型小鼠实验中,使用人GAPDH基因特异性引物进行PCR检测,在体内对UC-MSCss进行了14d的追踪以评估HA对移植的UC-MSCss在卵巢中停留时间的影响,添加HA组中,UC-MSCss移植后7d仍能观察到PCR产物,而在无HA组中,3d后就检测不到阳性条带。结果表明,HA在很大程度上延长了UC-MSCss在卵巢中的停留时间。在POF小鼠模型中,将UC-MSCss/HA移植到卵巢后,cKit、p-cKit、p-AKT、p-S6K和p-rpS6表达水平有所恢复,HE染色显示卵巢中卵泡数增加,不同阶段的卵泡占比均有上升,并验证了UC-MSCss增强HGF、VEGF、SCF和EGF等细胞因子的分泌,其中HGF通过激活PI3K-Akt通路促进卵泡存活,且HA还协调增强UC-MSCss的旁分泌功能,并促进这一过程[35]。总的来说,MSCs联合细胞支架移植到卵巢内,可有效治疗POF,改善卵巢内分泌及生殖功能,提高女性的生育能力。

5 结论与展望

综上所述,MSCs联合细胞支架是治疗POF的有效方法,各类细胞支架的使用无论从卵泡体外培养、卵巢组织移植或原位注射中均提高了MSCs疗法的疗效,且在体外卵泡培养实验中1%CS支架更具优势。虽然这一治疗方法得到了学术界的认可,但仍有许多问题需更进一步研究。目前的研究验证了MSCs通过旁分泌或自分泌、调节免疫、调控基因表达等多种方式发挥治疗作用[43],然而细胞之间的作用精细复杂,因治疗涉及患者健康安全问题,其治疗机制、对机体的远期影响等仍需进一步研究,探索优化MSCs移植方案,以确定最佳注射部位以及MSCs的最佳治疗剂量。尽管对MSCs的研究已深入到临床实验阶段,然而现有的MSCs制剂标准主要针对安全性(如病原体检测)和细胞类型(如分子标记物)进行检测,仍缺乏针对MSCs功能评价的标准。如何能快速选取功能强大的MSCs也将成为未来研究需攻克的重点和难点。目前支架制造材料种类繁多,制备方法各异,如何能构造出安全、高效、性价比高的支架尚无定论。随着医学的不断发展,相信在不久的将来MSCs治疗能为众多饱受POF煎熬的患者带来福音。