胎盘体外模型的研究进展*

刘佳乐,漆洪波,张 华,陈 昶**

(1.重庆医科大学生命科学研究院,重庆 400016;2.重庆医科大学附属妇女儿童医院,重庆 400013;3.重庆医科大学附属第一医院产科,重庆 400016)

胎盘位于母体和胎儿血管床之间,是妊娠期间胚胎、胚膜和母体子宫内膜联合长成的母子间组织结合器官。胎盘对于维持胎儿的生命至关重要,其主要功能是进行母胎之间的物质交换和支持胎儿的生长发育[1]。胎盘发育障碍和功能缺陷与多种妊娠并发症相关,包括先兆子痫、早产、不明原因死产和胎儿宫内生长受限。因此,对于胎盘的研究可帮助了解相关妊娠并发症的发病机制,为临床诊疗提供帮助。

阐明胎盘的发育和功能具有重要意义,但由于伦理问题和不同物种间胎盘解剖和发育的巨大差异,动物模型仅能提供有限的关于人类胎盘的信息[2]。为了更详细地研究人类胎盘的发育和功能,研究人员开发了多种体外模型,包括体外人胎盘小叶灌注模型以及近期开发的胎盘芯片、滋养层干细胞和类器官培养模型。本综述简要描述人类胎盘生物学,以及介绍以上3种模型的研究进展。

1 人类胎盘生物学

人卵子和精子结合形成受精卵,到达子宫后转化为囊胚,定植于子宫内膜,胎盘的发育由此开始。植入前的囊胚分化成内细胞团和滋养外胚层,囊胚在植入子宫内表面上皮5～6d后,滋养外胚层迅速增殖并分化为细胞滋养层(cytotrophoblast,CT),随后CT分化为合胞体滋养层(syncytiotrophoblast,SCT)和绒毛外滋养层(extravillous trophoblast,EVT)。SCT是由CT融合形成的覆盖在胎盘绒毛上的多核细胞,是母胎之间进行气体、营养交换和产生激素的主要场所。CT侵入子宫内膜,形成EVT。EVT的作用是将胎盘固定在子宫上,并向子宫内膜深部浸润,形成细胞柱,使子宫螺旋动脉重塑以增加血流量[3]。除滋养层细胞外,胎盘内还有滋养层巨细胞、霍夫鲍尔细胞、胎儿内皮细胞和蜕膜细胞等细胞,这些细胞对于胎盘的发育和功能也有重要意义[1]。

2 体外人胎盘小叶灌注模型

人胎盘小叶灌注模型是研究胎盘物质转运的重要工具。通常取产后的胎盘作为模型基础,不会对母体和胎儿产生伤害。Panigel等[4]于1967年首次描述了体外人胎盘小叶灌注模型,1972年由Schneider等[5]建立了体外人胎盘小叶双重灌注模型。该模型经过发展变化,可适用于包括药代动力学、纳米颗粒转移、血管张力调节、分泌功能、病毒感染等方向的研究。模型通过灌流管连接同一胎盘小叶的脐静脉与脐动脉建立胎儿侧循环,另一灌流管插入螺旋动脉残端建立母体侧循环,模式图见图1。Hutson等[6]指出,体外人胎盘小叶双重灌注模型是预测妊娠后期胎盘药物转运的有效方法。近期有研究将灌注模型与数学建模结合,提高对胎盘功能的理解[7]。离体胎盘灌注模型也存在一些缺陷[7]:(1)建立在妊娠晚期的成熟胎盘上,无法用于妊娠早、中期胎盘转运的研究。(2)建立过程复杂,成功率较低(15%～20%)。(3)模型难以长时间维持胎盘组织的活性。在大多数研究中,胎盘灌注时间只有2～6h,仅有部分能达到48h,无法研究药物的慢性暴露。

3 胎盘芯片

Lee团队在2015年提出了胎盘芯片(Placenta-on-a-Chip)的方法,将微流控和微加工技术与胎盘滋养层绒毛膜癌细胞系培养相结合,用于模拟胎盘屏障的生理结构[8]。这种微器件由两个聚二甲基硅氧烷(polydimethylsiloxane,PDMS)微流体通道组成,利用薄细胞外基质(extracellular matrix,ECM)膜隔开人滋养层细胞(human trophoblastic cell lines JEG-3,JEG-3)和人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs),并进行分区灌注共培养,模式图见图2。该研究通过分析葡萄糖在模型上的转运验证其转运功能,结果与先前报道的体内研究结果一致。微流体系统能模拟胎盘屏障血流动力学微环境,而且该模型的双层结构比传统细胞培养的2D平面结构更接近胎盘屏障的生理结构。研究人员利用该法研究了纳米颗粒和咖啡因等物质的转运。2021年Pu等应用3D微流体胎盘芯片模型建立胎盘侵袭微环境,模拟滋养层细胞与内皮细胞在滋养层微环境中的相互作用,并应用于毒理学测试[9]。2022年Mosavati等[10]在胎盘疟疾和葡萄糖转运研究中提到胎盘芯片模型中单向血流的局限性:子宫动脉血流是双向的,应在适当剪切应力下通过摇摆运动使模型变为双向流动,以模拟胎盘血液流动分叉。Richardson等[11]建立了三培养胎盘芯片模型,用3个PDMS微流控培养室分别培养SCT(毛喉素诱导BeWo融合形成)、CT(BeWo)和HUVEC,模拟胎盘滋养层-内皮层双层结构;测试了普伐他汀和瑞舒伐他汀在模型上的扩散、代谢和效能,验证了模型在研究胎盘药代动力学方面的实用性。2022年6月,Deng等[12]建立了诱导人多能干细胞(human pluripotent stem cell,hPSC)衍生滋养层干细胞(human Trophoblast stem cell,hTSC)方法与胎盘芯片结合的模型。该模型为微流体系统和ECM组成的3D培养室,允许hPSC衍生的hTSC分化为包含CT、SCT和EVT的滋养层样组织。对动态环境培养的滋养层细胞的分析结果表明,剪切应力能促进hPSC衍生的hTSC分化为滋养层细胞。但与原代滋养层相比,该模型的滋养层样组织的成熟度和功能还有一定差异。此外,培养条件还需进一步验证。这是首个胎盘芯片与诱导hPSC衍生hTSC结合的模型,未来可能成为一种有力的胎盘研究工具。

图2 胎盘芯片模式图

Pemathilaka等[13]研究表明,胎盘芯片是非常实用的体外模型,可模拟胎盘动态生理环境,成本较低。Pemathilaka对胎盘芯片目前存在的挑战进行了总结:(1)研究人员近几年专注于模型的制造过程,仅对部分药物的转运进行了研究,目前还缺乏胎盘生理特性方面的研究;(2)模型需要复杂的验证测试和质量控制;(3)模型所需的PDMS无法大规模制造。此外,PDMS对疏水性小分子的吸附能力,可能影响模型在药物测试领域的应用。研究认为,用水凝胶替代PDMS可提升装置的软机械性能[14]。胎盘芯片可精准控制胎盘物质交换的各种关键参数,但需要耐心和细致的细胞培养,防止细胞污染影响研究结果。胎盘芯片模型刚刚起步,虽然还存在一些技术上的挑战,但这种应用微工程技术解决问题的方法正在成为一种新的趋势。

4 滋养层干细胞和类器官培养

胎盘滋养层细胞对于人类胎盘发育和功能的研究至关重要,但之前的滋养层细胞培养模型主要使用原代细胞和永生化细胞系。原代滋养层细胞难以分离纯化,通常寿命有限且易发生表型变化;永生化细胞系则来源于绒毛膜癌(如Bewo、JAR和JEG-3等),虽然相对稳定且易于获取,但与原代滋养层细胞存在差异[2]。2018年,研究人员开发了2D结构的滋养层干细胞培养模型[15]和3D结构的人滋养层类器官模型[2],在胎盘滋养层体外模型研究领域实现了重大突破。

4.1 滋养层干细胞培养 小鼠滋养层干细胞来源于囊胚和植入后的胚胎外胚层,是分析小鼠滋养层细胞分子生物学的最佳体外模型。2018年Okae等从人CT和囊胚中分离出了hTSC细胞,建立了人胎盘滋养层干细胞培养模型,为研究人类滋养层的发育和功能提供了重要工具[15]。

对原代滋养层的转录组进行分析,发现上皮干细胞增殖所必需的Wnt和表皮生长因子(epidermal growth factor,EGF)信号通路相关基因在原代CT中表达最高,研究数据预测CT可能在其他上皮干细胞的培养条件下保持增殖。基于转录组分析结果,研究测试了各种可增强干细胞增殖的细胞因子,发现含有CHIR99021、EGF、转化生长因子β(transforming growth factor-β,TGF-β)抑制剂、VPA和Y27632的培养基能实现CT细胞的长期培养。后续又对hTSC向EVT和SCT分化进行了研究,发现除了含CHIR99021的基础培养基外,hTSC向EVT分化还需要NRG1、A83-01和基质胶Matrigel。向SCT分化则需aAMP激动剂forskolin和EGF。培养出的增殖性CT具有分化为SCT和EVT的能力,因此被定义为CT来源的hTSC。该研究从妊娠早期胎盘中获得了hTSC细胞,并能持续增殖至少5个月,但无法从足月胎盘中获得此类细胞。该研究培养的hTSC和分化细胞的转录组、甲基组具有许多滋养层细胞特征[16],并且与原代滋养层细胞高度相似。将hTSC植入非肥胖糖尿病(non-obese diabetic,NOD)-重症联合免疫缺陷(severe combined immune deficiency mice,SCID)小鼠,发现可模仿滋养层侵入过程。最近有研究实现了从足月胎盘中获得hTSC[17],该研究表明ΔNp63α与GCM1之间存在拮抗作用,发现缺氧和使用EGF/CASVY上调ΔNp63α活性抑制GCM1表达,可促进CT转化为hTSC。

近期出现了另一种获得hTSC的方法:诱导人多能干细胞(human pluripotent stem cell,hPSC)衍生hTSC。hPSC包括人胚胎干细胞(human embryonic stem cell,hESC)和人诱导多能干细胞(human induced pluripotent stem cells,hiPSC),hiPSC由成纤维细胞等体细胞通过转录因子介导的重编程产生[18]。Castel等[18]研究中描述了将人体细胞重编程为hiPSC再衍生hTSC的路线图。数个研究已实现了从幼稚hPSC诱导产生hTSC,而有争议的是从始发态hPSC诱导hTSC过程中需要使用骨形态发生蛋白4(bone morphogenetic protein-4,BMP4)处理,但这可能导致羊膜标志物活化,使诱导产生的细胞更接近羊膜谱系[19]。研究发现,C19MC miRNA表达对hTSC干性的维持非常重要,但始发态hPSC衍生的hTSC并不表达大多数C19MC miRNA[20],并且在始发态hPSC衍生的hTSC中重新激活C19MC miRNA的表达,也无法恢复其增殖和分化潜力。Jang等[21]研究表明,经短期BMP4处理的始发态hPSC可诱导为hTSC,与真正的hTSC具有相似的表达谱,并且在长期培养中具有自我更新和分化能力。Cui等[22]研究中,实现了诱导始发态hPSC在3D ECM培养下形成滋养层样组织,并发现了生理微环境对滋养层分化的重要性。Wei等[23]报道了BMP4显著增强从始发态hPSC诱导生成hTSC这一过程,以及敲除H3K27甲基转移酶(EZH1/2)可提高诱导效率。在上文关于胎盘芯片模型的介绍中,提到了滋养层干细胞与芯片模型结合,用于研究动态环境对hPSC诱导为hTSC的影响[12]。

hTSC表达多种转运蛋白,这表明它们可作为研究胎盘转运和代谢活性的模型[23]。但是滋养层干细胞模型无法模拟滋养层细胞的3D组织结构,于是研究人员开发了下述的3D滋养层类器官模型。

4.2 滋养层类器官 与干细胞培养模型相比,类器官在解剖和功能上更接近活体的器官。Haider等[24]从纯化的妊娠早期胎盘滋养层细胞中,建立了可自我更新的3D滋养层类器官。研究人员从妊娠6～7周的胎盘中分离纯化出CT细胞,在特定条件下进行培养,几天内便形成小细胞团,并在2～3周内迅速增殖发育成不规则的器官样物质。类器官大约每14d传代1次,并且可连续传代超过5个月。培养条件包括抑制TGF-β和BMP信号传导的A83-01和Noggin、EGF,激活Wnt信号的R-spondin,糖原合成酶激酶3α和3β(GSK-3α/β)抑制剂CHIR99021,以及前列腺素E2。该研究对培养物进行了分析,表明类器官细胞与人原代CT细胞的特性、干性、增殖标志物以及基因表达高度相似。

Turco等[2]开发了用于研究胎盘形成过程中母胎相互作用的滋养层类器官模型。该模型比Haider等[24]的模型更完善,培养物可长期增殖,遗传稳定且具有定向分化能力。Turco等研究了妊娠6～8周时滋养层的信号通路,设计出由EGF、FGF2、CHIR99021、A83-01和Rspondin-1组成的基础滋养层有机介质(TOM),后续又向TOM中添加了HGF、PGE2和Y-27632,发现CT在该培养条件下能在第二次传代后(10～14d内)形成均匀的滋养层类器官。研究发现EGF对于CT的增殖最重要,其次是Y-27632、A83-01和CHIR99021。该研究描述了SCT融合和人滋养层类器官形成过程,并且证明了该类器官在解剖和功能上与体内胎盘非常相似,还讨论了HLA-G+EVT的分化与侵袭作用。2020年,在Turco的方法基础上,Sheridan等[25]对其进行了改进,并讨论了与之前方法的区别。该研究在TOM中添加FGF2和Y-27632并去除Noggin,可增强细胞的增殖和存活率,EVT分化改为hTSC模型研究中的方法[15]。该培养方法传代时间更短,仅需7～10d,且能连续传代一年以上。

近两年滋养层类器官逐渐开始应用于胎盘研究领域。Xu等设计了基于人滋养层类器官的高通量免疫荧光筛选方法,筛选和鉴定常用有机磷酸盐阻燃剂(organophosphorus flame retardants,OPFRs)中破坏胎盘的化学物质[26]。Kreis使用滋养层类器官模型研究了细胞周期调节因子p21及其基因家族中的p27和p57在胎盘发育和子痫前期发病中的作用[27]。Sheridan等[25]表明,滋养层类器官不仅可用于研究滋养层的发育和功能,还可用于胎盘产物的分析。Sheridan等研究中提到了滋养层类器官的局限性:目前无法从足月胎盘中获得滋养层类器官,而且类器官中没有基质、内皮和骨髓来源的胎盘细胞。

目前已经有将干细胞和类器官两种方法结合的模型——干细胞衍生的类器官模型[28]。最新研究发现,幼稚hPSC来源的hTSC也能形成滋养层类器官[29],这种类器官具有与之前滋养层类器官相当的组织结构、胎盘激素分泌和长期自我更新的能力。该研究证明了类器官中多种细胞的滋养层身份和分化能力,表征了从幼稚hiPSC到建立类器官过程中的X染色体失活动力学,并用该模型探讨了胎盘发育和对不同病原体的易感性。滋养层干细胞和类器官模型培养的细胞与原代滋养层细胞的表达谱差异较小,细胞合成分泌功能接近,未来可作为研究胎盘合成分泌功能的理想模型。滋养层干细胞和类器官细胞培养模式图见图3。

图3 滋养层干细胞和类器官培养过程示意图

5 讨 论

体外人胎盘小叶灌注模型在胎盘屏障功能、物质转运和胎儿药物暴露等研究方向有成熟的应用。其最大的优势是拥有完整的人类胎盘结构,在解剖学上最接近生理状态。但其缺点在于无法用于胎盘早、中期的研究,且操作复杂,难以开展标准化、规模化研究。胎盘芯片能模拟胎盘的部分多层结构和屏障功能,且可提供其他细胞培养模型缺少的胎盘动态环境,实验程序相对简易且重复性良好,更适合用于孕早、中期胎盘的屏障和转运功能研究(如高通量药物转运研究),但不太适用于研究胎盘的发育过程和分泌功能。相反,滋养层干细胞和类器官的生理特性更接近原代滋养层细胞,更适用于研究胎盘的发育过程和分泌功能,但由于其结构难以区分母体面和胎儿面,因此暂不适用于研究胎盘的屏障和转运功能。

本文介绍了三种胎盘体外模型的发展和应用,以及目前存在的局限性。综上所述,三种模型各有优缺点,在应用领域方面形成互补,可根据具体研究目的选择合适的胎盘体外模型。随着分子生物学和生物工程等技术的快速发展,胎盘体外模型将不断创新和优化,为该领域的研究带来广阔前景。