凤冈锌硒茶茶多酚提取工艺优化及其体外活性研究

王绪英，朱淼，李欣燃

（六盘水师范学院生物科学与技术学院，贵州 六盘水 553004）

茶多酚是茶叶中具有丰富生物活性的化合物之一，不仅对人体健康具有重要的保护作用，而且能够提升动物的免疫力和抗病能力［1］。研究发现，低中浓度的硒存在时，增加锌浓度有利于茶叶中茶多酚、氨基酸、可溶性糖、黄酮和咖啡碱等主要化学品成分含量的提高［2］。李（Li）等［3］发现补硒能够促进茶叶的次级代谢，从而增加茶多酚的含量。森特科斯卡（Sentkowska）和皮辛斯卡（Pyrzynska）［4］发现硒和茶多酚具有协同抗氧化作用。以上研究表明，锌、硒元素能够有效促进茶多酚的富集，同时提升生物活性。茶多酚作为茶叶主要的活性物质，不仅具有良好的抗氧化［5］、抗菌和抗病毒作用［6］，并且还具有调节动物肠道菌群［7］，促进饲料利用率的作用［8］，已有报道说明锌和硒是饲料中重要的微量元素添加剂，能够改善饲喂动物的产肉性能［9,10］。因其能够提升动物的免疫力和抗病能力，已被广泛应用于动物生产过程。因此，茶多酚的提取方法和得率成为研究的热点之一。

在过去的研究中，已有许多关于茶叶中茶多酚提取的文章，其中涵盖了不同品种茶叶以及不同提取方法的实验结果。在张媛婷等［11］的研究中，他们通过超声辅助正交实验，在绿茶中提取茶多酚，得到的提取率为19.68%。马小雨等［12］利用响应面优化微波辅助技术，在绿茶中提取茶多酚的得率达到了25.65%。都昌乐等［13］通过超声波辅助正交实验，在桐城小花茶中提取茶多酚，得率为15.62%。陈仕学等［14］则采用浸提辅助正交实验，在石阡黑茶中提取茶多酚，得率为10.06%。从以上实验结果可以看出，不同茶叶品种之间存在显著差异，这就导致了茶多酚的提取方法和得率也有所不同。

贵州省凤冈县所出产的凤冈锌硒茶，因其富含锌、硒两种元素而得名，其中锌、硒的含量分别能达到40~100 mg/kg 和0.25~3.50 mg/kg［15］，是当地的国家地理标志产品。须要指出的是，目前尚无对凤冈锌硒茶茶多酚提取优化的相关研究，又鉴于凤冈锌硒茶中富含锌、硒元素，有必要对其主要的天然化学成分及其生物活性进行深入分析。本研究采用超声辅助的方式，通过响应面法，对凤冈锌硒茶中茶多酚提取工艺条件进行优化，并通过体外实验，考察茶多酚的抗氧化活性以及降血糖和血脂的功效，为凤冈锌硒茶茶多酚的进一步开发利用提供技术参考及科学依据。

1 材料、仪器与方法

1.1 材料与仪器

材料：凤冈锌硒茶，购自贵州黔福茗茶茶叶有限责任公司；硫酸亚铁（≥99.5%）、甘氨胆酸钠水合物（≥98.0%）、酒石酸钾钠（≥99%）、磷酸二氢钾（≥99%）、牛磺胆酸钠（≥97.0%）、没食子酸标准品（≥99%）、氢氧化钠（≥98.5%），均购置于生工生物工程（上海）股份有限公司；透析袋MD34 7000 Da、胃蛋白酶1∶3000、胰蛋白酶1∶250，均购置于北京索莱宝股份有限公司。

仪器：超声波仪（SB-800DT，宁波新芝），电子分析天平（AUW120D，岛津），中药粉碎机（DFT-200，海新诺）、烘箱（HH-2A，上海博迅），紫外分光光度计（UV-2100，北京东西分析），离心机（TD5，湖南赫西），摇床（WHA-S，铂温仪器）。

1.2 实验方法

1.2.1 构建标准曲线

试验通过酒石酸亚铁显色法测定茶多酚含量［16］。其标准曲线制作方法如下：首先，配置浓度为0.5 mg/mL 的对照品溶液。用电子分析天平称取0.125 0 g 没食子酸对照品，添加蒸馏水定容至250 mL，获得对照品溶液。然后，取对照品溶液0 mL、0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL、1.0 mL、1.2 mL、1.4 mL、1.6 mL 依次加入2 mL 酒石酸亚铁溶液，再依次加入磷酸盐缓冲液补齐至10 mL，混匀放置10 min，然后在紫外分光光度计波长为540 nm处进行检测。最后，拟合出标准曲线y=14.514 x-0.024 4（R2=0.997 8）。

1.2.2 单因素试验

取凤冈锌硒茶茶叶于烘箱中，40℃时烘至恒重，粉碎后过40目筛备用。依次考察超声提取时间（min）、料液比（g/mL）及乙醇体积分数（%）三个单因素试验条件对凤冈锌硒茶茶多酚得率的影响。首先，维持料液比1∶90（g/mL）、乙醇体积分数60%不变，将超声波仪超声时间（min）依次设置为10 min、20 min、30 min、40 min、50 min、60 min，以考察超声时间对茶多酚得率的影响；其次，维持超声时间50 min、料液比1∶90（g/mL）不变，检测乙醇体积分数依次为30%、40%、50%、60%、70%、80%时，凤冈锌硒茶茶多酚得率；再次，设定超声提取时间为50 min，乙醇体积分数为60%时，依次考察料液比（g/mL）为1∶60 g/mL、1∶70 g/mL、1∶80 g/mL、1∶90 g/mL、1∶100 g/mL、1∶110 g/mL 时，对凤冈锌硒茶茶多酚得率的影响。茶多酚得率计算方法如下：

式中：D 表示茶多酚得率（%）；表示提取液中茶多酚的质量（g）；表示锌硒茶干粉质量（g）。

1.2.3 响应面法优化设计

选取凤冈锌硒茶茶多酚得率为响应值，根据单因素试验结果，选取A-乙醇体积分数、B-提取时间和C-料液比为三个自变量，构建三因素三水平响应面分析试验。试验条件设计如表1所示。

表1 响应面各因素试验条件设计

1.2.4 抗氧化活性检测

根据响应面实验结果，得到凤冈锌硒茶茶多酚提取最优工艺。将提取液梯度稀释为0.2 mg/mL、0.4 mg/mL、0.8 mg/mL、1.2 mg/mL 和1.6 mg/mL，以抗坏血酸为对照，采用1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）自由基的清除试验［17］和羟自由基的清除试验［18,19］进行抗氧化活性检测。

1.2.5 凤冈锌硒茶茶多酚葡萄糖透析延迟指数分析

取10 μg/mL、20 μg/mL、30 μg/mL、40 μg/mL、60 μg/mL和80 μg/mL各1 mL葡萄糖标准品，置于冰上，依次加入10 mL 蒽酮硫酸试剂，制成样液。然后放入沸水中煮沸7 min后取出，立即置于冰水中，冷却后于紫外分光光度计波长为620 nm 处，测定各管吸光度值并构建标准曲线［20］。

在1 支干净的试管中加入1 mL 样液，再向试管中加入10 mL100 mmol/L 葡萄糖，置于摇床，37℃时震荡1 h，然后倒入透析袋中，将透析袋放入装有去离子水的杯中继续振荡，模拟肠道吸收情况，每20 min 取杯中液体进行葡萄糖含量检测。同时取另一只透析袋，添加等量的100 mmol/L葡萄糖作为对照。葡萄糖含量检测公式如下：

式中：GDRI为凤冈锌硒茶茶多酚的透析延迟指数（%）；为样品组杯中液体含有的葡萄糖浓度（g/L）；为对照组杯中液体含有的葡萄糖浓度（g/L）。

1.2.6 凤冈锌硒茶茶多酚对两种胆酸盐的结合能力

分别在6 支试管中依次添加0.05 mmol/L、0.1 mmol/L、0.15 mmol/L、0.2 mmol/L、0.25 mmol/L、0.3 mmol/L 各1mL 的牛磺胆酸钠标准溶液，再分别加入10 mL60%，制成样液。在70 ℃水浴锅中反应40 min，取出冷却后，于紫外分光光度计波长为387 nm处，测量各管吸光度值，制作标准曲线［21］。

牛磺胆酸钠结合力检测：取1 mL 样液与3 mL10 g/L 胃蛋白酶于1 支干净试管中混合成样品，添加1 mL0.01 mol/L HCl 调节pH，置于摇床，37 ℃时震荡1 h，再次添加0.01 mol/L HCl 将样液pH 调整为6.3。向样品中添加4 mL10 g/L 胰蛋白酶，继续置于摇床，37 ℃时震荡1 h。取出后，向其中加入4 mL 0.5 mmol/L牛磺胆酸钠，再次放置摇床，37 ℃时震荡1 h，使之充分结合。将样品取出后置于4 000 最高转速（rpm）离心机上离心10 min，并按上述标准曲线测定方法进行测定。

甘氨胆酸钠结合力检测方法同上。

两种胆酸盐结合力检测公式如下：

式中：R 为凤冈锌硒茶茶多酚对胆酸盐结合能力（%）；为胆酸盐的加入量（mmol）；为胆酸盐的剩余量（mmol）。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

2.1.1 提取时间对凤冈锌硒茶茶多酚得率的影响

考察超声提取时间对凤冈锌硒茶茶多酚得率的影响。结果如图1所示。

图1 提取时间对凤冈锌硒茶茶多酚得率的影响

由图1 可知，提取液中的凤冈锌硒茶茶多酚含量，先随着提取时间的延长而逐渐增加，当提取时间达到50 min 时，凤冈锌硒茶茶多酚得率达到最大。但提取时间进一步增加时，凤冈锌硒茶茶多酚含量不增反降。可能是由于时间过长，导致凤冈锌硒茶所含有的其他物质溶出，降低了茶多酚的比率。可见在50 min 时，茶多酚全部溶出，所以选择提取时间为50 min 时进行优化试验。

2.1.2 料液比对凤冈锌硒茶茶多酚得率的影响

考察料液比对凤冈锌硒茶茶多酚得率的影响。结果如图2所示。

图2 料液比对凤冈锌硒茶茶多酚得率的影响

由图2 可知，提取液中的茶多酚含量随着料液比增加而逐渐增加，当达到1∶90（g/mL）时，茶多酚得率趋势基本不变，说明在料液比为1∶90（g/mL）时，凤冈锌硒茶茶多酚已全部析出，其得率达到最大。综合考虑回收成本，因此选择料液比为1∶90（g/mL）时进行优化试验。

2.1.3 乙醇体积分数对凤冈锌硒茶茶多酚得率的影响

考察乙醇体积分数对凤冈锌硒茶茶多酚得率的影响。结果如图3所示。

图3 乙醇体积分数对凤冈锌硒茶茶多酚得率的影响

由图3可知，当乙醇浓度逐渐增加时，凤冈锌硒茶茶多酚含量也逐渐增加，其体积分数为60%时，凤冈锌硒茶茶多酚得率最大；当浓度进一步升高时，茶多酚得率又逐步降低。这可能是由于此浓度（60%）下的有机溶剂和锌硒茶茶多酚的极性相近，随着乙醇浓度的不断增加，杂质增多，干扰因素也随之增多，导致酚类化合物析出量减少。因此选择在乙醇浓度为60%左右进行优化试验。

2.2 响应面法结果

2.1.1 回归模型的建立与分析

博克斯-本肯（Box-Behnken）实验设计方案是一种优化的响应面法，在考察相同数量的条件因子时，这种实验方案能够显著降低所要分析的因子组合数量，减少实验次数。本研究以凤冈锌硒茶茶多酚得率为响应值，采用Design-Expert 8.06软件设计Box-Behnken 实验方案，分析三因素三水平响应面试验。具体结果如表2所示。

表2 博克斯-本肯（Box-Behnken）试验设计与结果

乙醇体积分数、提取时间以及料液比三个因素对锌硒茶茶多酚得率影响大小分别为：B>C>A，即：时间>料液比>乙醇体积分数。得到各因素对凤冈锌硒茶茶多酚得率拟合回归方程如下：

Y=-61.796 25+0.304 13A+0.737 63B+1.057 75C+6.250 00×AB+8.000 00×AC-2.350 00×BC-3.512 50×-5.262 50×-5.387 50×

对上述结果作方差分析，结果如表3所示。

表3 方差分析

由表3 可以看出，试验模型<0.000 1，失拟误差=0.494 3，说明该模型具有较好拟合程度。

2.2.2 回归模型响应面分析

依据响应面试验所得数据，进行回归拟合后，得到如图4 所示的凤冈锌硒茶茶多酚得率响应面图。

图4 各交互因素对凤冈锌硒茶茶多酚得率的影响

图4a和图4b响应面坡度变化均较平和缓慢，表明这些因素的交互作用对凤冈锌硒茶茶多酚提取影响较弱。而图4c响应面坡度较为陡峭，说明时间和料液比的交互作用对凤冈锌硒茶茶多酚得率影响较大。

2.2.3 工艺验证

根据以上结果，得到凤冈锌硒茶茶多酚提取最佳方案为乙醇体积分数58.65%、提取时间53.53 min、料液比1∶91.17（g/mL），茶多酚得率为14.79%。为方便操作，将凤冈锌硒茶茶多酚提取工艺进行优化，即：乙醇体积分数调整为59%、超声提取时间调整为54min、料液比调整为1∶91（g/mL）。并进行3次生物学平行试验，最终茶多酚平均得率为14.88%，与预测值的相对标准偏差为0.61%。

2.2.4 抗氧化活性检测结果

考察凤冈锌硒茶茶多酚提取物和抗坏血酸对DPPH清除率，结果如图5所示。

图5 凤冈锌硒茶茶多酚提取物和抗坏血酸对DPPH清除率

由图5 可知，凤冈锌硒茶茶多酚提取物与抗坏血酸对DPPH 清除率随浓度增加而增大，且略高于抗坏血酸，茶多酚提取物的I为0.87 mg/mL。

考察凤冈锌硒茶茶多酚提取物和抗坏血酸对羟自由基清除率，结果如图6所示。

图6 凤冈锌硒茶茶多酚提取物和抗坏血酸对羟自由基清除率

由图6 可知，凤冈锌硒茶茶多酚提取物对羟自由基清除率略高于抗坏血酸，且随浓度增加而增大，茶多酚提取物的I为0.45 mg/mL。

可见，锌硒茶茶多酚具有较好的抗氧化活性。

2.2.5 葡萄糖透析延迟指数

该指标可用于间接反映肠道吸收过程的延迟情况。凤冈锌硒茶茶多酚对葡萄糖延迟吸收的能力如图7所示。

图7 凤冈锌硒茶茶多酚提取物对葡萄糖的透析延迟能力

由图7可知，葡萄糖透析20 min时，凤冈锌硒茶茶多酚提取物对葡萄糖延迟吸收能力（46.50±6.18）%显著高于葡萄糖透析40 min（23.48±5.86）%和60 min（14.39±3.17）%。延迟指数的降低可能与透析时间有关。凤冈锌硒茶茶多酚对葡萄糖的吸收能力随着时间延长而产生饱和状态，从而达到动态平衡。

2.2.6 胆酸盐结合能力

胆汁酸由肝脏分泌，通常以甘氨酸和牛磺酸（体积比3∶1）的形式存在，可促进脂溶性物质的水解，降低胆酸盐含量，可作为降血脂的参考指标。凤冈锌硒茶茶多酚提取物对胆酸盐的结合能力如图8所示。

图8 凤冈锌硒茶茶多酚提取物对胆酸盐的结合能力

如图8 所示的试验结果表明，凤冈锌硒茶茶多酚对牛磺胆酸钠和甘氨胆酸钠均具有一定的结合能力，分别为16.38±3.53%和27.69±6.38%，可初步证实茶多酚具有一定的体外降脂活性。

3 结论

通过对凤冈锌硒茶茶多酚提取工艺优化及体外活性的初步研究，表明其具有较好的抗氧化活性、延迟葡萄糖吸收能力以及胆酸盐结合能力。通过响应面辅助优化法来探索凤冈锌硒茶中茶多酚的提取条件，最终得到其最佳提取率为14.88%。这项研究将为凤冈锌硒茶中茶多酚的优化提供新的思路和方法，并为进一步开展茶叶中茶多酚的研究，以及开发利用茶叶中的生物活性物质提供重要的依据。

研究结果可作为一种更为经济和环保的方法，全面促进凤冈锌硒茶茶多酚资源化利用，同时为其在动物生产过程中的深入开发与应用提供参考。后续可将提取的茶多酚作为饲料添加剂，进一步进行动物实验研究，以便该研究结果可以在动物生产实际应用中发挥更大作用。