新型靶向αvβ6多肽的设计、 合成与亲和力评价

李跃鹏, 王远强

(重庆理工大学 药学与生物工程学院, 重庆 400054)

整合素是细胞黏附分子家族中的重要成员之一, 是一组跨膜糖蛋白受体, 广泛分布于细胞表面. 整合素的主要功能是介导细胞与细胞、 细胞与细胞外基质之间的相互黏附, 并介导细胞与细胞外基质之间的双向信号传导, 对细胞的黏附、 增殖、 转移、 凋亡起重要的调控作用. 整合素是由α亚基和β亚基通过非共价键组成的跨膜异二聚体糖蛋白, 目前已发现18种α亚基和8种β亚基, 可形成24种不同的整合素受体[1]. 其中,αvβ6是唯一由β6亚基参与形成的异源二聚体整合素. 整合素αvβ6在健康的成人上皮中不表达或表达很弱, 但在创伤愈合、 纤维化和炎症等生理或病理过程中, 甚至在一些恶性肿瘤中, 它的表达水平显著上调, 该特征使整合素αvβ6在各种疾病诊断与治疗中成为一个非常有吸引力的靶点[2-3].

目前文献报道的靶向αvβ6配体包括小分子配体和多肽类配体, 其中多肽类配体主要包括定向工程化噬菌体展示获得的多肽R01和S02[4], 基于向日葵胰蛋白酶抑制剂噬菌体展示筛选得到的多肽SFLAP3[5], 源于口蹄疫病毒外壳的多肽A20FMDv2[6], 噬菌体展示文库筛选得到的多肽DLXXL[7], 以及天然配体Pro-TGF-β1和TGF-β3[8]. 其中[18F]氟苯甲酰基标记的肽[18F]FBA-A20FMDv2已在人类临床试验中用作PET放射性示踪剂, 用于特发性肺纤维化的诊断和治疗评估. 研究表明, 尽管多肽配体没有直接的抗癌活性, 但可以作为分子成像载体用于癌症等疾病诊断, 以及通过与药物或纳米粒的偶联进行整合素靶向肿瘤治疗. 靶向整合素放射药物已是比较成熟的研究方向, 此类药物结合了两种关键元素: 一种靶向化合物/配体和一种放射性同位素[9]. 靶向放射性药物可以与肿瘤组织中的特异性靶点结合并聚集, 通过放射性射线产生电离辐射作用, 由于正常组织细胞与肿瘤组织细胞对射线的敏感性不同, 因此可以实现肿瘤的靶向治疗或根据放射性射线对肿瘤进行精准诊断. 如177Lu-PSMA-617(Novartis)即将被批准用于前列腺癌的诊疗[10], 由北京大学王凡课题组研发的中国首个核医学肿瘤显像诊断1类新药99mTc-3PRGD2已完成三期临床[11]. 因此开发具有靶向αvβ6作用的多肽配体具有重要意义.

针对目前αvβ6结合多肽基本含有RGDLXXL(X为任意氨基酸)核心结构, 且该结构处于专利保护范围内, 本文拟筛选设计非专利范围内全新结构的αvβ6结合多肽配体. 先通过分子模拟方法分析αvβ6与多肽配体的结合模式, 再通过计算机辅助药物设计方法发现一种全新结构的αvβ6多肽配体, 该配体具有良好的结合亲和力, 可为后续的靶向αvβ6多肽和多肽-核素复合物研究提供理论与实际研究指导, 是一个具有发展前景的先导化合物.

1 材料与方法

1.1 试剂和仪器

Fmoc-氨基酸(上海麦克林生化科技股份有限公司), 2-氯代三苯甲基氯-树脂(阿拉丁试剂(上海)有限公司), 二氯甲烷(DCM)、 二甲基甲酰胺(DMF)、 二异丙基乙胺(DIEA)和乙腈等(国药集团化学试剂有限公司), 人整合素αvβ6蛋白(MedChemExpress LLC)、 链霉亲和素-辣根过氧化物酶(Streptavidin-HPR)和3,3′,5,5′-四甲基联苯胺(TMB)显色液(上海碧云天生物技术有限公司), A20FMDv2(NAVPNLRGDLQVLAQKVART)、 A20FMDv2-Biotin(Biotin-NAVPNLRGDLQVLAQ-KVART)和A20FMDv2-GRD(NAVPNLGRDLQVLAQKVART)(核欣(苏州)医药科技有限公司), 酶联免疫吸附试剂盒(江苏酶免实业有限公司).

液相制备色谱仪(LC-20AP型, 日本岛津公司); 三重四级杆液-质联用仪(AGILENT 6470型, 美国安捷伦科技有限公司); 全波长酶标仪(Multiskan SkyHigh型, 美国赛默飞世尔科技公司).

1.2 分子模拟方法

1.2.1 分子对接

采用Sybyl-X 1.3进行分子对接, 靶蛋白αvβ6源自蛋白质结构数据库(Protein Data Bank, https://www.rcsb.org, ID: 5FFO), 配体来源于文献、 有机小分子生物活性数据库(PubChem, https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov)和药物化学数据库(Chembl, https://www.ebi.ac.uk/chembl/)等. 使用Sybyl软件的Surflex-Dock模块, 将蛋白晶体结构中天然配体所在位置定义为活性结合口袋. 利用Surflex-Dock GeomX(SFXC)模块进行高精度分子对接, 分子对接参数: 配体分子初始构像数目为10, 分子片段最大构像数目为20, 分子最大可旋转键数据为100, 其他参数默认. 综合结合构像和对接打分构建αvβ6-多肽复合物用于分子动力学模拟.

1.2.2 分子动力学模拟和结合自由能计算

本文所有分子动力学模拟均在Linux工作站用Amber 16[12]计算.αvβ6使用FF14SB力场, 多肽配体使用GAFF力场和AM1-BCC电荷, 将多肽-蛋白体系浸没于0.15 mol/L氯化钠溶液(TIP3P)的立方体盒子中, 复合物距立方体盒子边缘为1.00 nm, 体系包含98个Na+, 78个Cl-, 36 206个水分子. 模拟过程如下: 首先进行5步能量优化, 避免可能的分子碰撞; 其次进行两步加热, 使体系温度从0逐渐升温到303.15 K, 并进行溶液密度调整和体系平衡; 最后在303.15 K下对系统(NPT)进行100 ns的动力学模拟, 时间步长为2 fs, 压力恒定为1个大气压. 结合自由能以及能量分解计算由Amber的MMPBSA.py程序完成[13], 选取最后20 ns进行计算并取其平均结构进行结合模式分析, 分析αvβ6与配体的结合模式. 当结合自由能的值为负值时, 体系是稳定的, 且该值越小配体-受体结合亲和力越高.

1.2.3 组合虚拟筛选

本文虚拟筛选由SYBYL-X 1.3完成. 首先以RGDLXXL为基础, 在5,6号位通过20种天然氨基酸的随机组合建立一个含400条多肽的多肽文库, 通过Rosetta软件[14]对多肽进行批量结构优化构建虚拟肽库, 根据1.2.1节中定义的活性口袋进行虚拟筛选, 综合结合构像以及对接打分筛选出最佳结合七肽. 然后将筛选出的七肽作为核心逐步延长多肽链, 同理筛选出最佳结合八肽、 九肽和十肽用于进一步研究. 结合模式分析结果表明, 现有多肽配体与αvβ6的结合主要为九肽和十肽核心结构, 因此将筛选出的九肽、 十肽和骨架RGDLXXL进行氨基酸替换, 如亮氨酸可替换为缬氨酸, 二者等电点相近, 分别为5.98和5.96, 侧链结构相似, 分别为异丙基和异丁基, 二者均为带疏水性侧链的脂肪族氨基酸, 氨基酸替换时在改变多肽结构的同时尽量不改变其理化性质. 在保持多肽关键结合氨基酸不变的情况下, 进一步构建虚拟肽库, 通过与上一步相同的虚拟筛选、 精准对接、 分子动力学模拟获得最佳结合多肽配体, 利用分子动力学模拟和结合自由能能量分解计算验证结构改造的合理性.

1.3 多肽固相合成方法

用DCM激活树脂后, 通过DIEA将第一个氨基酸耦联到树脂上, 然后用哌啶/DMF保护第一个氨基酸, 通过茚三酮实验确认氨基酸耦合后用DMF和甲醇洗涤树脂. 使用预活化的第二个氨基酸、 肽耦合试剂HBTU和DIEA溶液进行耦联, 确认耦联后, 重复洗涤, 重复去保护和耦合循环, 直到获得所需的肽链长度. 最后将树脂结合的多肽转移到圆底瓶中, 通过n(TFA)∶n(H2O)∶n(EDT)∶n(TIS)=94.5∶2∶2.5∶1的组合溶液同时去除树脂和保护基团. 再利用制备型高效液相色谱结合梯度洗脱对多肽进行分离纯化, 其中乙腈/水为流动相, 检测波长为214 nm. 最后用液质联用仪(LC-MS)确认目标产物.

1.4 ELISA法测定结合亲和力

人源αvβ6蛋白经包被、 封闭后, 在孔板中加入待测配体溶液. 其中空白组仅加入100 μL TBS缓冲溶液; 空白对照中加入A20FMDv2-Biotin 和TBS缓冲溶液各50 μL; 阳性对照加入A20FMDv2-Biotin 和A20FMDv2(梯度)各50 μL; 阴性对照加入A20FMDv2-Biotin 和A20FMDv2-GRD各50 μL; 实验组加入A20FMDv2-Biotin 和待测多肽(梯度)各50 μL. 每组设置3个平行试验. 反应2 h后, Streptavidin-HRP用PBST稀释100倍, 向各孔加入100 μL, 室温振摇反应后, 向各孔加入100 μL TMB显色液, 立即将孔板置于酶标仪中避光孵育, 每5 min读取一次650 nm波长处的吸光度(A)值, 共读取1 h(13个检测点).

2 结果与讨论

2.1 αvβ6与现有配体的结合模式

现有αvβ6多肽配体的分子对接与结合自由能计算结果列于表1. 由表1可见, 分子对接打分选取结合构像最佳的对接结果, 所有配体分子与αvβ6的结合自由能为-147.753 4～-92.888 7 kJ/mol. 结合自由能能量分解结果表明,αvβ6与多肽配体形成的基本强相互作用: ArgRGD侧链通过氢键与αv亚基Asp218上的羧基形成氢键; 多肽的侧链残基与β6亚基种金属离子依赖的黏附位点中Mg2+形成配位键; 配体中-LXXL-部分可以形成两亲性α螺旋, 并且该螺旋结构与β6亚基形成的特异性疏水口袋结合, 该结合模式为后续设计的多肽是否合理建立标准.

表1 现有αvβ6配体分子对接以及结合自由能计算结果

2.2 靶向αvβ6多肽配体的设计

以RGDLXXL为核心初步筛选多肽配体的分子对接以及结合自由能计算结果列于表2. 结合自由能除七肽较低为-26.318 6 kJ/mol外, 其他3条多肽结合自由能均小于-62.802 0 kJ/mol. 虚拟筛选的多肽与αvβ6结合模式如图1所示. 由图1可见, 七肽除必要的结合作用外, 还与Tyr178形成键长为0.29,0.39 nm的氢键, 并与Glu698形成键长为0.35 nm的氢键; 八肽除必要的结合作用外, 还与Asn693和Ser602分别形成键长为0.38,0.31 nm的氢键; 九肽除必要的结合作用外, 还与Tyr178,Asp729,Thr696,Asp695分别形成键长0.32,0.32,0.40,0.38 nm的氢键; 十肽除必要的结合作用外, 还与Tyr178,Ser602,Thr696分别形成键长为0.40,0.32,0.39 nm的氢键.

图1 虚拟筛选的多肽与αvβ6结合模式Fig.1 Binding patterns of virtual screening of polypeptides and αvβ6

表2 多肽虚拟筛选、 设计分子对接以及结合自由能计算结果

考虑到现有研究中的配体均基于RGDLXXL配体, 本文对初步筛选出的九肽和十肽的氨基酸残基进行替换筛选, 探索全新结构的αvβ6多肽配体, 最终得到2条多肽, 分别为RGDVGRVGR和RTDVGRVRGR. 2条多肽配体与αvβ6结合模式如图2所示. 由图2可见, 2条多肽与αvβ6的结合模式与现有配体一致: 多肽RTDVGRVGRG除必要的结合作用外, 还与Asp150,Asp148,Ile147,Glu121,Ser656,Glu698分别形成键长为0.29,0.34,0.35,0.31,0.32,0.32 nm的氢键; 多肽RGDVGRVGR除必要的相互作用外, 还与Tyr178,Asp695,Thr696,Lys119,Ser656,Pro654,Lys645分别形成键长为0.38,0.27,0.23,0.33,0.29,0.29,0.28 nm的氢键.

图2 氨基酸替换后多肽结合模式Fig.2 Polypeptide binding pattern after amino acid substitution

2.3 多肽合成结果

本文合成了4条多肽, 分别为P1(GRTDLGTLLFR), P2(GRRTDLATIHG), P3(RTDVGRVRGR), P4(RGDVGRVGR). 其中P2为pro-TGF-β1配体的RGD特征片段[15-17], 在后续研究中作为设计多肽亲和力测定的对照, P1为重庆理工大学靶向药物筛选与活性评价课题组原有肽库筛选出的配体, P3和P4为本文结构优化后的多肽配体.

根据高效液相色谱(HPLC)结果, P1纯度为98.461%, P2纯度为95.749%, P3纯度为95.135%, P4纯度为97.554%. 根据LC-MS结果, P1计算的摩尔质量为1 248.42 g/mol, 测量的摩尔质量为1 249.00 g/mol; P2计算的摩尔质量为1 196.31 g/mol, 测量的摩尔质量为1 196.70 g/mol; P3计算的摩尔质量为1 171.31 g/mol, 测量的摩尔质量为1 171.35 g/mol; P4计算的摩尔质量为971.07 g/mol, 测量的摩尔质量为971.25 g/mol. 可见, 经HPLC以及LC-MS分析, 确定合成的多肽为本文研究的目标产物.

2.4 亲和力测定结果

酶联免疫吸附(ELISA)实验采用饱和浓度法进行计算[18], 即体系反应达到最大响应值的50%时的浓度为结合亲和力浓度. 每个孔位设置3组平行试验, 测量数据结果显示标准差不超过平均值的15%. 测试样品吸光度在进行计算时应减去标准品浓度为0的A平均值, 即只加了TBS缓冲液的孔位吸光度. 采用A20FMDv2作为阳性对照(亲和力3 μmol/L), 利用Origin 2016对标准品吸光度及浓度绘制四参数逻辑函数曲线, 计算阳性对照达到最大反应响应值的浓度约为40 μmol/L, 如图3所示. 利用Biotin标记的A20FMDv2作为检测目标分子, Streptavidin-HRP可与Biotin-A20FMDv2形成稳定复合物, 当待测多肽与αvβ6结合时溶液中的Biotin-A20FMDv2浓度增加, TMB可与Streptavidin-HRP生成蓝色化合物进而检测溶液吸光度. 根据4条待测多肽的A值以及浓度、 阳性标准品的吸光度, 绘制多肽-蛋白结合率和多肽浓度相关性曲线, 结果如图4所示. 由图4和吸光度数据可以计算出P1的亲和力为3.35 μmol/L, P3的亲和力为10.76 μmol/L.

图3 阳性对照A20FMDv2的浓度-吸光度曲线Fig.3 Concentration-absorbance curve of positive control A20FMDv2

图4 待测多肽的浓度-结合率曲线Fig.4 Concentration-binding rate curves of tested polypeptide

2.5 讨 论

本文通过分子对接与分子动力学模拟分析αvβ6与配体的结合模式, 虚拟组合筛选获得符合结合模式的全新结构多肽, 采用固相合成法合成多肽, 通过间接ELISA法测定多肽配体与αvβ6的结合亲和力. 实验结果表明: 多肽配体P3与αvβ6具有良好的结合亲和力, 略大于阳性对照A20FMDv2的结合亲和力, 基本符合设计预期. 实验中P2和P4由于亲和力较弱, 仅存在阳性结果, 无法计算其亲和力值. P1虽然也有较强的αvβ6蛋白结合亲和力, 但其结构仍具有RGDLXXL核心, 因此在后续的研究中可作为先导化合物改造其结构. P3和P4虽都为氨基酸替换后筛选出的多肽, 但其结合亲和力差距较大. 综合分子对接和结合自由能相关计算结果, 推测P4活性较差的原因是其-VGRVGR-部分的空间位阻较小, 而αv与β6亚基形成的结合空腔较大, 二者结合时存在一定的结合不稳定性. 结构生物学研究表明,αvβ6不仅能识别RGD序列, 还能识别-LXXL-基序, 该基序折叠成两亲性α-螺旋, 结合至β6亚基残基组成的疏水口袋中[15-17]. 研究中筛选出全新结构多肽含有的-VXXV-序列也可以形成两亲性α-螺旋, 该螺旋可与β6亚基形成更多氢键相互作用, RTD序列也可以与αvβ6形成稳定的氢键, 表明了本文采用氨基酸替换方法的合理性. 可见, 计算机辅助药物设计方法可有效提高药物开发的成功率、 降低研发成本并缩短研发周期, 是创新药物研发的重要方法.

文献研究表明, 整合素αvβ6的表达在许多肿瘤中显著上调, 包括口腔鳞癌、 乳腺癌、 胃癌、 胰腺癌、 结直肠癌、 肺癌等[18-20]. 整合素αvβ6的表达与许多癌种患者的生存率降低相关, 例如结直肠癌、 乳腺癌、 胰腺导管腺癌、 非小细胞肺癌和宫颈鳞状细胞癌等[21-25], 并且可以通过纤维连接蛋白和胶原中的RGD序列参与肿瘤细胞与胞外基质的相互作用, 该整合素的过度表达与上皮细胞向间充质样细胞转化有关, 可促进肿瘤细胞的侵袭和迁移, 通常在肿瘤侵袭病灶的前沿部分中整合素的表达水平较高. 目前, 靶向整合素成像已成为整合素研究热点之一, 包括正电子发射断层扫描和单光子发射计算机断层扫描, 整合素显像剂可用于对患者分层进行靶向治疗、 评估治疗反应, 并监测肿瘤生长[26-30]. 由于大部分基础生物学仍未完全了解, 因此αvβ6为靶标的治疗肿瘤药物也尚未开发, 但其仍有作为诊断靶点的潜力.

综上所述, 本文采用计算机辅助药物设计的方法设计了一条基于RTDVXXV全新结构的αvβ6多肽配体, 研究结果表明, 该配体具有良好的结合亲和力, 配体分子可作为靶向αvβ6多肽或肽类结合物开发的候选分子, 为未来αvβ6结合配体的开发提供结构基础.