生物炭对高粱根际土壤线虫的影响

孙靓楠，红 雨，2，3，王伶瑞，薛转转，吴艳玲，2

（1.内蒙古师范大学 生命科学与技术学院，内蒙古 呼和浩特 010022；2.内蒙古自治区高等学校蒙古高原生物多样性保护与可持续利用重点实验室，内蒙古 呼和浩特 010022；3.无穷维哈密顿系统及其算法应用教育部重点实验室，内蒙古 呼和浩特 010022）

土壤线虫是一类较低等的异养多细胞真核生物［1］，是土壤动物中物种多样性最高的一类，也是土壤食物网的重要组成部分［2］。土壤线虫可依据生活方式和头部形态学特征将其划分为4 种营养类群，分别为食细菌类线虫（BF）、食真菌类线虫（FF）、植食类线虫（PP）以及捕食-杂食类线虫（OP）［3］。土壤线虫通过与其他土壤动物的相互作用参与到复杂的生态网络中，占据土壤食物网中的大多数重要位置，在有机质分解、养分循环和能量传递等关键生态过程中发挥重要作用［4］。土壤线虫群落的生态功能是指土壤线虫与非生物环境的相互关系以及在环境多因子驱动下的物质转换等生态过程［5］。研究表明，土壤线虫通过促进植物与土壤间的负反馈、改变根际微生物群落和促进养分循环而影响植物生长［6］。作为土壤生态系统的重要指示生物之一，土壤线虫能迅速响应土壤环境变化［7］，因此以线虫为基础的生态指标可以较为准确地反映土壤生态功能的变化，为土壤健康的评估提供参考［8］。

生物炭是利用农业废弃物在低氧或缺氧条件下，经高温（<700 ℃）热解形成的一类高度芳香化的富含碳质的难溶性固体物质［9］，用于废物处理、减缓气候变化、提高土壤肥力、生物能源生产和污染物修复等一系列应用［10］。生物炭可以从各种各样的废弃生物质中产生［11］，这使得废物处理成为可能，生物炭可以通过提高土壤肥力和植物生产力实现粮食安全管理，通过固碳和最大限度减少温室气体排放减缓气候变化，并修复土壤、水和空气中的污染物，广泛的适用性表明生物炭在全球可持续发展中可以发挥关键作用［12-13］。生物炭还在作物可持续生产过程中扮演着重要角色，具有调节土壤理化特性与生物群落等作用［14］。牛亚茹［15］研究表明，生物炭改变了土壤线虫群落结构，适量生物炭能够使食细菌类线虫增加，短期内施加生物炭对土壤线虫的群落多样性和稳定性均没有显著影响。随着我国对农业绿色发展的重视程度逐步增加，以线虫生态指标为主的土壤健康评价受到更多关注，并将其用于指导田间施肥措施的优化［16］。本试验采用生物炭改良高粱根际土壤，通过研究施加不同含量生物炭对土壤线虫群落的影响，进一步探讨施加不同含量生物炭对土壤生态系统的影响。

1 材料与方法

1.1 研究区概况

研究样地位于内蒙古自治区鄂尔多斯市达拉特旗昭君镇（图1），地处内蒙古自治区西南部，属于温带大陆性季风气候，冬冷夏热，四季分明，降水集中且年降水量较少。地下煤炭资源丰富，储量达20 多亿吨。样地坐标为40°25′1″N，109°35′33″E。采集鄂尔多斯市达拉特旗昭君镇高粱样地25 个样点的高粱根际土壤，地块面积约为670 m2，样点分布为处理-对照间隔分布，试验土壤为砂质土壤。

1.2 试验方案

以鄂尔多斯杭锦旗沙质化土地和盐碱化土壤为改良对象，以伊泰北牧田园公司种植的农作物秸秆为生物炭原料，利用炭化技术制备生物炭。炭化后的生物炭基本保留了原有生物质的良好孔隙结构，具有较大的孔隙度和比表面积。2021 年4 月，生物炭施于样地土壤表层后，与土壤耕层（0～20 cm）搅拌混匀。施用量根据盆栽实验所得结论设置5 个水平，分别为：对照组Z0（0 kg生物炭/hm2）、Z1（10 kg 生物炭/hm2）、Z2（30 kg 生物炭/hm2）、Z3（50 kg 生物炭/hm2）、Z4（70 kg 生物炭/hm2），采用随机区组设计进行分区小组试验，在2021 年4 月20 日种植高粱，高粱品种为高杂4 号和辽粘3 号，高粱生长期间除正常灌水耕种，不再添加其他影响因素。2021 年10 月，采集高粱样地的土壤用于测定土壤化学指标。采样高粱根际土壤，每个分区随机采集5 次重复；此外，去除地表板结的部分，沿根系生长的方向将高粱根系全部挖出，轻轻抖动根系，再挑选粘有土壤的根放入灭菌离心管，置于液氮罐中，送回实验室在-80 ℃保存备用。各重复土样共计25 份。

1.3 样品分析

土壤理化性质测定参考《土壤农化分析》，土壤pH 测定用pH 计；土壤有机质测定（OM）采用重铬酸钾外加热法；土壤速效氮（AN）测定方法为碱解扩散法；速效磷（AP）含量测定方法为0.5 mol/L NaHCO3法。冻干管中的土样送至上海美吉生物公司，由公司进行DNA 抽提，用1% 的琼脂糖凝胶电泳检测DNA 的提取质 量，然 后 采 用 引 物NF1F5′-GGTGGTGCATGGCCGTTCTTAGTT-3′和18Sr2bR5′-TACAAAGG GCAGGGACGTAAT-3′进行PCR 扩增，Miseq 文库构建和测序等利用PE 300 平台进行测序，之后在美吉生物云平台对土壤线虫数据进行分析。

1.4 数据处理

利用SPSS 18.0 对土壤线虫的多样性指数和土壤理化性质进行单因素方差分析，用Origin 2022 b 软件绘图。在上海美吉生物公司云平台进行在线分析，对土壤线虫进行OTU 水平分析并生成Venn 图，将不同施炭量与土壤线虫的关系生成Circos 样本与物种关系图，在土壤线虫属水平上进行多样性分析，基于Bray-Curtis 距离算法对土壤线虫群落进行PCoA 分析，对土壤理化性质与土壤线虫相关性进行热图分析。

图1 样地位置Fig.1 Plot location

2 结果分析

2.1 OTU 水平相似性分析

OTU 即操作分类单元。通过一定的距离度量方法计算两两不同序列之间的距离量度或相似性，继而设置特定的分类阈值，获得同一阈值下的距离矩阵，进行聚类操作，形成不同的分类单元。分析之前，根据序列间的相似性（通常为97%）将序列进行聚类，分成多个分类单元，一个分类单元称为一个OTU。然后再基于OTU 分类单元进行物种注释，常规方法在OTU 分类单元中选出一条代表序列，用此序列进行物种注释得到的结果即为整个OTU 单元的注释结果［17-18］。

图2 OUT 水平分布韦恩图Fig.2 Wayne diagram of OUT horizontal distribution

通过对样本的分析，得到OTU 水平分布韦恩图（图2）。由图2 可知，Z0 组OTU 数目最高为44；Z2 组OTU 其次，数目为38；Z4 组OTU 数目为36；Z3 组OTU 数目略低于Z4 组为35；Z1 组OTU 数目最低为31。从两处所重合的OTU 数目对比可得：Z0 组与Z3 组的线虫群落相似性最高为31；Z0 组与Z4 组的相似性其次为29；Z0 组与Z2 组的相似性为28；Z0 组与Z1 组的相似性为27。

2.2 土壤线虫组成分析

通过OTU 物种分类可知，该样地内的土壤线虫种类共计1 门3 纲7 目23 科33 属（图3）。除未分类的线虫外，食细菌类线虫（BF）有8 种、食真菌类线虫（FF）有3 种、植食类线虫（PP）有12 种、捕食-杂食类线虫（OP）有4 种。其中Z0样地植食类线虫占48.69%，Z1 样地植食类线虫占63.13%，Z2 样地植食类线虫占65.59%，Z3 样地植食类线虫占33.75%，Z4 样地植食类线虫占49.55%；而Z0 样地杂食-捕食类线虫占16.88%，Z1 样地中杂食-捕食类线虫占4.93%，Z2 样地中杂食-捕食类线虫占6.45%，Z3样地中杂食-捕食类线虫占12.94%，Z4 样地中杂食-捕食类线虫占1.63%。结果表明，随着施炭量的增加，植食类线虫在样地内的相对丰度呈单峰变化趋势（低浓度促进，高浓度抑制），且仍为优势类群，杂食-捕食类线虫随施炭量增加而降低。

图3 属水平土壤线虫组成结构图Fig.3 Composition structure of soil nematodes at genus level

从属处理上可得，Z0 组线虫种类最多，共24 属；Z2 组线虫种类有23 属；Z1 组和Z4 组的线虫种类属数均为20；Z3 组线虫种类数最少，为16 属。其中Z0 组和Z2 组有3 个特有属；Z4 组有2 个特有属；Z1 组有1 个特有属；Z3 组没有特有属。5 组共有的线虫属有10 属。除未分类的线虫外，Z0 组的优势属有3 个；Z1、Z2、Z4 组的优势属均有3 个且种类相同；Z3 组的优势属有5 个（表1）。

Z2 组的稀有属最多，有14 属；Z0 组的稀有属有12 个；Z1 组的稀有属有10 个；Z4 组的稀有属有10 属；Z3 组的稀有属最少，有7 属，见表2。

表1 特有属及优势属Tab.1 Endemic genus and dominant genus

表2 稀有属Tab.2 Rare genus

2.3 土壤线虫多样性分析

把5 组样本进行α多样性分析得到多样性指数表（表3）。由表3 可知，每个样本群落覆盖率高达99.7%～99.9%，说明本次实验结果具有代表性。5 组样本土壤线虫多样性的Shannon 指数排序为Z4

表3 土壤线虫多样性指数Tab.3 Diversity index of soil nematode

PCoA 主坐标分析如图4 所示。由图4 可知，前两个主成分累积贡献率分别为28.85% 和16.58%。Z1 组样本点距离最近，说明该组重复性强，Z4 组样本点距离最远，说明该组重复性弱。5 个样本间的差异性不显著。

2.4 土壤理化性质分析

土壤pH 值5 个样地差异均不显著，由大到小顺序为Z1>Z0=Z4>Z2>Z3（图5）。在不同样地土壤理化性质中（图6），有机质含量Z4 样地最高为27.053 g/kg，Z0 样地最低 为7.155 g/kg，Z4 样地显 著高于其 他4 个样地（P<0.05），Z2 样地显著高于Z0、Z1 和Z3 样地（P<0.05），Z3样地显著高于Z0 样地，与Z1 样地差异不显著（P>0.05），Z0 样地与Z1 样地无显著差异（P>0.05）；速效磷含量Z1样地显著高于Z0、Z3 样地（P<0.05），其余4 个样地差异均不显著（P>0.05）；速效氮含量5 个样地均无显著差异。

2.5 土壤理化性质与土壤线虫关联分析

Pearson 相关性系数是度量两组数据相关性程度的值，数值小于0 呈负相关，大于0 正相关，等于0 不相关。热图是用颜色来更直观，明显的展现数据。由土壤理化性质与土壤相关性热图（图7）可知，AN 的含量与Leptonchus细齿属（FF）及Cylindrolaimus筒咽属（BF）两属呈显著正相关（P<0.05）；pH 与Campydora独壁齿属（OP）呈显著负相关，与Cylindrolaimus筒咽属（BF）呈极其显著正相关；OM 含量与Ecumenicus遍居属（OP）呈极其显著负相关，与Miculenchus米 卡 垫 刃 线 虫 属（PP）、Funaria_f ＿Leptonchidae 及 unclassified_o ＿ Dorylaimida 未 分 类 的矛线目（PP）三属呈显著负相关；AP 含量与Eumonhystera真单宫属（BF）呈显著负相关，与Thada萨达属（PP）呈显著正相关，与Telotylenchus端垫刃属（PP）呈极其显著正相关。在4 个土壤理化性质指标中OM 含量对土壤线虫群落影响较大，AN 含量其次，AP 含量和pH 对土壤线虫群落的影响较小。

图4 PCoA 分析图Fig.4 The diagram of PCoA analysis

图5 不同样地土壤pHFig.5 The soil pH in different plots

3 讨论

图6 不同样地土壤理化性质Fig.6 The soil physical and chemical properties in different plots

3.1 不同施炭量对土壤线虫生物多样性的影响

在农田管理措施中，耕作、灌溉以及施肥等人为因素都能改变土壤肥力及土壤微生物特性，从而影响土壤线虫群落［19］。其中施肥不仅会通过改变土壤理化性质来影响土壤线虫群落组成，还会通过改变土壤微生物、植物等生物因子来影响土壤线虫［20］。

本文在5 个样地共检测出了33 个属的土壤线虫，其中未添加生物炭的对照组Z0 样地Shannon 指数，Ace 指数及Chao1 指数最高；添加了50 kg 生物炭/hm2的Z3 样地Ace 指数及Chao1 指数最低、添加了70 kg生 物 炭/hm2的Z4 样 地Shannon 指 数 最 高，Simpson指数最低。说明土壤线虫群落多样性随生物炭施放量增加而降低。

植食类线虫作为土壤线虫中的优势类群，随着生物炭施炭量的增加呈单峰模式变化，即低浓度促进，高浓度抑制。这可能是因为适量的施加生物炭增加了植物生物量，形成了更多的取食位点，有利于植食类线虫的取食与繁衍，进而增加其相对丰度［21］。叶成龙等［19］研究发现施用有机肥能增加土壤植食类线虫的相对丰度，与本研究结果一致。杂食-捕食类线虫一般被看作是决定土壤食物网复杂程度的关键生物类群［22］，对环境变化敏感［23］，随施炭量增加杂食-捕食类线虫在各样地线虫群落中的相对丰度减小，说明群落结构越稳定。

图7 不同样地土壤理化性质与土壤相关性热图Fig.7 The heat map of correlation between soil physical and chemical properties and soils of different plots

3.2 土壤理化性质对土壤线虫群落的影响

土壤理化性质的变化会影响土壤线虫群落结构［24］，本文通过Pearson 相关性系数分析，得出土壤有机质（OM）是影响土壤线虫群落最主要的环境因子，这与杨涛等［25］的研究结果一致。其他研究结果表明，土壤线虫含量与土壤有机质的分解和土壤物质循环密切相关［26］。施加生物炭量增加导致土壤有机质（OM）含量增高，线虫群落的食物来源更加丰富，促进了食物网的结构化，使其更加复杂。代江慧等［27］认为pH 对土壤细菌多样性和结构具有调控作用，且pH 降低可导致土壤细菌生物量降低。土壤pH 和氮等养分含量，可以通过影响植物根系生长和微生物活性等间接影响地下资源的质量和数量对线虫群落组成产生直接或间接影响。高静等［9］研究发现土壤pH 的变化是由诸多因素共同造成的，不同生物炭种类及含量对不同性质的土壤酸碱度影响不同，本实验中施加不同生物炭量对土壤pH 的影响不显著，对土壤线虫群落影响较小。

4 结论

利用高通量测序技术，对比分析了不同生物炭施炭量条件下的土壤线虫群落，主要从土壤线虫群落的生物多样性及土壤理化性质两方面来分析。研究发现，施加不同量的生物炭能不同程度的降低土壤线虫的多样性指数，与不添加生物炭的对照组相比，施加生物炭量越高，土壤线虫群落的丰富度越低。施加的生物炭量越高土壤有机质（OM）的含量越高，且差异显著（P＜0.05），对土壤线虫群落的影响也越大；速效氮（AN）含量随生物炭施放量的增加而降低，但无显著差异，对土壤线虫群落影响较大；速效磷（AP）和pH 对土壤线虫群落影响较小。