麦角硫因抑制紫外辐射诱发自由基的试验研究

孙 赫，王丽丽，康传利，廉少杰，陈建英

（1.山东省药学科学院 山东省皮肤与黏膜给药工程技术研究中心，山东 济南 250101；2.山东省药学科学院 新型缓控释制剂与药物靶向递送系统山东省工程研究中心，山东 济南 250101；3.国家药监局药物制剂技术研究与评价重点实验室，山东 济南 250101；4.山东百阜福瑞达制药有限公司，山东 济宁 273100；5.山东福瑞达医药集团有限公司 山东省黏膜与皮肤给药技术重点实验室，山东 济南 250101）

1909年Charles Tanret从麦角菌（Claviceps purpurea）中分离出含硫晶体化合物，并命名为麦角硫因（ergothioneine，EGT）。EGT作为一种天然手性氨基酸衍生物，存在硫醇和硫酮两种互变异构形式，在人体内主要以硫酮形式存在[1]。与烷基硫醇谷胱甘肽（RSH）不同，这种咪唑硫酮结构在溶液中不会自氧化，也不会在铁盐和氢过氧化物存在下诱导芬顿反应[2]。研究表明EGT可抑制脂质过氧化损伤[3]，清除羟自由基（·OH）[4]、超氧化物和单线态氧（1O2）等多种活性氧（ROS）物质，是优异的皮肤光敏保护剂[5-7]。人体内的EGT并不是由人体本身合成，而是由放线菌、分枝杆菌等微生物合成后，通过植物吸收和食物链传递至人体内积累而存在的。

皮肤衰老是机体衰老最直接的表现，除自然衰老等内部因素外，引起皮肤衰老的还有诸如自然环境、外伤、接触某些化学物质等外界因素，其中最重要的是日晒，即光老化。阳光中的紫外辐射照射到人体表皮细胞后可产生1O2、·OH等有害物质，诱发DNA、蛋白质和细胞组织的损伤，并表现为皮肤的衰老和损伤。本文通过紫外线照射光敏剂罗丹明B（RhB）溶液诱发包括1O2在内的自由基体系（下文简称UV-RhB体系）[8-10]，模拟紫外线照射人体皮肤产生ROS的情况，研究EGT在此体系下的抗氧化性能及其稳定性，以期为EGT应用于抗衰护肤品的开发提供理论依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Infinite M200PRO 酶标仪（Tecan）；MS204TS/02 电子天平（Mettler Toledo）；SCIENTZ 03-II 紫外交联仪（新芝生物科技股份有限公司）。

1.2 试药

EGT（化妆品级，批号：220308，山东百阜福瑞达制药有限公司）；维生素C（药用级，东北制药集团股份有限公司）；罗丹明B及其他试剂均为分析纯。

2 方法

2.1 UV-RhB体系中EGT和VC抗氧化性能的测定

以pH 7.2的磷酸盐缓冲液（PBS，取2.2 g Na2HPO4，0.3 g NaH2PO4和8.5 g NaCl，加水溶解至1000 ml）为溶剂，分别配制0.001 %罗丹明B溶液（RhB）、0～1.00 mg/ml的EGT溶液及维生素C（VC）溶液。按表1配制测定溶液体系I、II，置紫外光（波长254 nm，光强度5 mW/cm2）下照射。分别于0，1 h时，采用酶标仪，测定555 nm波长处吸收值（A0和A1），每个样品平行3份，计算0 h和1 h吸光度变化量的平均值（ΔA），以ΔA空白为基线，按下式计算体系中活性物质的抗氧化性能（F）。

表1 抗氧化作用测定溶液体系

式中，ΔA空白：空白对照溶液的吸收值的变化量（A0空白-A1空白）；ΔA样品：样品溶液的吸收值的变化量（A0样品-A1样品）。

2.2 离子强度对EGT抗氧化性能的影响

按表1配制测定溶液体系III，EGT溶液浓度为0.25 mg/ml，以EGT浓度为0的体系作为空白对照，分别加入NaCl浓度分别为0 %，0.40 %，0.85 %，1.30 %，1.75 %的PBS。按2.1项下方法平行测定3份，取其平均值，计算不同离子强度体系的ΔA和F值。

2.3 pH值对EGT抗氧化性能的影响

按表1配制测定溶液体系IV，EGT溶液浓度为0.25 mg/ml，以EGT浓度为0的体系作为空白对照，用0.1 mol/L HCl溶液和0.1 mol/L NaOH溶液分别调节PBS缓冲液pH值为3.0，5.0，7.2，9.0，11.0。按2.1项下方法平行测定3份，取其平均值，计算不同pH体系的ΔA和F值。

2.4 还原剂对EGT抗氧化性能的影响

按表1配制测定溶液体系V，EGT溶液浓度为0.25 mg/ml，并以EGT浓度为0的体系作为空白对照，Na2SO3溶液以PBS缓冲液为溶剂，浓度分别为0 %，0.02 %，0.05 %，0.10 %，0.25 %，0.50 %。按2.1项下方法平行测定3份，取其平均值，计算不同还原剂浓度体系的ΔA和F值。

2.5 金属离子对EGT抗氧化性能的影响

按表1配制测定溶液体系VI，其中溶剂为生理盐水，EGT溶液浓度为0.25 mg/ml，并以EGT浓度为0的体系作为空白对照。分别加入0.05 mol/L的K+、Mg2+、Zn2+、Cu2+、Fe3+生理盐水溶液。按2.1项下方法平行测定3份，取其平均值，计算不同金属离子体系的ΔA和F值。

2.6 EDTA对EGT抗氧化性能的影响

按表1配制测定溶液体系VII，其中溶剂为生理盐水，EGT溶液浓度为0.25 mg/ml，并以EGT浓度为0的体系作为空白对照。分别加入0.10 mol/L的Fe3+溶液和0 %，0.02 %，0.04 %，0.10 %，0.20 %的EDTA溶液。按2.1项下方法平行测定3份，取其平均值，计算不同EDTA浓度体系的ΔA和F值。

3 结果与分析

3.1 EGT和VC的抗氧化量效关系

不同浓度EGT和VC的抗氧化性能见图1。由图1可见，0～1 mg/ml范围内，EGT和VC的F值随浓度的升高而增大，且相同浓度下EGT的F值一直高于VC，表明EGT和VC抗氧化作用具有较好的量效关系，同时在此体系下EGT的抗氧化性能优于VC。

图1 不同浓度EGT和VC的抗氧化性能

3.2 离子强度对EGT抗氧化性能的影响

离子强度对EGT抗氧化性能的影响见图2。由图2可见，NaCl浓度在0 %～0.85 %范围内，EGT的F值较为稳定，当NaCl浓度高于0.85 %时，F值急剧下降，表明此时EGT抗氧化性能受到体系内高离子强度的抑制而显著降低。

图2 离子强度对EGT抗氧化性能的影响

3.3 pH值对EGT抗氧化性能的影响

pH值对EGT抗氧化性能的影响见图3。由图3可见，在pH 5～9范围内EGT的F值变化相对较小，表明EGT抗氧化活性在pH 5～9范围内较为稳定。

图3 pH值对EGT抗氧化能力的影响

3.4 还原剂对EGT抗氧化性能的影响

还原剂亚硫酸钠对EGT抗氧化性能的影响见图4。由图4可见，随着亚硫酸钠浓度的增大，F值呈下降趋势，表明在此体系中加入亚硫酸钠可抑制EGT的抗氧化活性。亚硫酸钠浓度大于0.1 %时，F值趋于稳定，表明其抑制作用趋于平缓。

图4 亚硫酸钠对EGT抗氧化性能的影响

3.5 金属离子对EGT抗氧化性能的影响

不同金属离子对UV-RhB体系的影响见图5A。结果显示，与Na+体系相比，K+、Mg2+、Zn2+体系中ΔA空白变化较小，表明加入这3种离子对体系内RhB的降解速率影响较小；Cu2+对RhB的降解速率有较明显的抑制，而加入Fe3+后，体系中RhB降解速率显著提高，分析原因为Fe3+在水中形成Fe(OH)2+，经光照射生成Fe2+和羟自由基[11-13]，增大了体系内自由基的浓度，进一步加剧了RhB的降解。

图5 不同金属离子对UV-RhB体系及EGT抗氧化性能的影响

不同金属离子对EGT抗氧化性能的影响见图5B。结果显示，与Na+体系相比，Zn2+对EGT抗氧化性能没有明显影响，K+、Mg2+对EGT的抗氧化作用有一定程度的抑制，Cu2+在抑制RhB降解的同时对EGT的抗氧化性能也有较为明显的抑制作用。而在体系中加入Fe3+，RhB降解速率提高的同时，EGT的抗氧化性能也得到了明显的提升，这也表明EGT可有效抑制Fe3+诱发的氧化应激反应。

3.6 EDTA对EGT抗氧化性能的影响

EDTA对EGT抗氧化性能的影响见图6。由图6可见，在添加Fe3+的体系中，EGT抗氧化性能随EDTA的浓度增加而减小，分析原因为EDTA与Fe3+形成金属络合物后降低了体系内Fe3+的浓度，削弱了Fe3+对UV-RhB体系和EGT抗氧化性能的影响。

图6 EDTA对EGT抗氧化性能的影响

4 结论

光老化、氧化自由基和皮肤糖化被认为是皮肤衰老的直接原因。其中，紫外照射皮肤后能产生1O2、脂质自由基、脂质过氧化物（LPO）等物质，降低皮肤细胞抗氧化防御能力，导致胶原蛋白酶和弹性蛋白酶的释放，并破坏两种蛋白质和结缔组织，造成皮肤衰老、损伤等多种问题。本文通过建立紫外辐射光敏剂诱发自由基体系，测定抗氧化活性物质的抗氧化性能。在此体系下EGT表现出优异的抗氧化性能，且在低离子强度和pH 5～9范围内具有良好的稳定性。