超高效液相色谱-四极杆/静电场轨道阱高分辨质谱鉴定三七极细粉中化合物及其口服吸收代谢成分

邱 慧，徐 倩，黄 霞，汪保林

（1.南昌市洪都中医院 制剂中心，江西 南昌 330008；2.南昌大学第二附属医院 药学部，江西 南昌 330006）

中药三七为五加科植物三七[Panax notoginseng(Burk.) F.H.Chen]的干燥根和根茎，具有散瘀止血，消肿定痛的功效，临床主要用于咯血，吐血，衄血，便血，崩漏，外伤出血，胸腹刺痛，跌扑肿痛[1]。三七在中医药中的临床应用有着十分悠久的历史，《医门密旨》、《跌损妙方》及《本草纲目》均有记载[2]，其根、茎、叶、花均可入药，是我国传统的珍贵药材，是云南白药、片仔癀、复方三七口服液及复方丹参滴丸等常见中成药中的主要组成药材。在民间用药中，三七经常被加工成极细粉，直接以温水送服，用于治疗中老年心脑血管疾病及跌打损伤等。目前，从三七中分离得到的化合物有百余种，主要以皂苷类成分为主，此外还有少量的黄酮、多糖、氨基酸、蛋白质及炔、醇类物质，其中皂苷类成分和三七素为主要活性成分[3-4]。目前关于三七代谢研究仅有少量报道，且主要针对三七中的主要活性物质人参皂苷Rg1、Rb1及三七皂苷R1的代谢研究[5-7]，迄今未见有关三七极细粉成分与人体口服吸收代谢的研究报道。本研究基于超高效液相色谱-四极杆/静电场轨道阱高分辨质谱（UHPLC-Q Exactive HRMS）定性分析技术，对三七极细粉乙醇提取物、三七极细粉口服吸收入血成分及尿液成分进行定性分析，并初步探讨其口服吸收代谢特征。

1 仪器与材料

1.1 仪器

Ultimate 3000型超高效液相色谱仪（美国Dionex公司）；Q-Exactive型四极杆/静电场轨道阱高分辨质谱（美国Thermo Fisher Scientific公司）；XS105DU和ME204E电子分析天平（瑞士Mettler Toledo公司）；Centrifuge 5430R高速冷冻离心机（德国Eppendorf公司）；Vortex-Genie2型涡旋混匀器（德国IKA公司）。

1.2 材料

人参皂苷Rg1对照品（批号：110703-202034），人参皂苷Rb1对照品（批号：110704-202129），三七皂苷R1对照品（批号：110745-201921），人参皂苷Re对照品（批号：110754-202129）均购自中国食品药品检定研究院；甲酸（HPLC级，阿拉丁）；甲醇、乙腈均为色谱纯（德国Merck公司）；纯净水（广州屈臣氏）；其他试剂均为分析纯。实验用药材三七购自樟树市庆仁中药饮片有限公司（批号：20200609，产地：云南），经本院制剂中心制成极细粉（批号：20210527）。

1.3 研究对象

健康男性受试者3名，年龄：30～40岁，体重：50～68 kg，空腹给药，采集样本后进食。受试者经病史询问，并经肝肾功能、尿常规和心电图检查证实无异常，无吸烟及嗜酒史，在两周内未服用其他药物，且每位受试者在实验前被告知试验内容，并经同意后签署知情同意书。

2 方法

2.1 UHPLC Q-Exactive HRMS条件

2.1.1 色谱条件 色谱柱：Waters BEH C18色谱柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）；柱温：35 ℃；流动相：0.1 %甲酸水（A）-乙腈（B），梯度洗脱（0 min，5 %B；3 min，19 %B；20 min，19 %B；60 min，40 %B；75 min，95 %B；82 min，95 %B；84 min，5 %B；90 min，5 %B）；流速：0.3 ml/min；进样量：2 μl。

2.1.2 质谱条件 加热电喷雾离子源（HESI），负离子模式，喷雾电压：3.0 kV（-），离子传输管温度：320 ℃，S-Lens出口透镜电压：60 V；雾化气流量：30 μl/min，辅助气：温度300 ℃，流量10 μl/min。扫描方式选择全扫/二级质谱扫描模式，Full MS中，分辨率为70 000半峰全宽（FWHM），自动增益控制目标离子数（AGC target）为3×106，允许最大离子注入时间（Maximum IT）为100 ms，离子扫描范围：m/z150～1500；ddMS2中，分辨率为17 500 FWHM，AGC target为1×105，Maximum IT为50 ms，离子扫描范围：m/z200～1500。

2.2 三七极细粉供试品溶液的制备

称取三七极细粉适量，置于锥形瓶中，称定重量，加入10倍量95 %乙醇，加热回流提取30 min，冷却至室温，称定重量，用95 %乙醇补足减失的重量，混匀，高速离心（12 000 r/min，10 min），上清用0.22 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。

2.3 对照品溶液的制备

取人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、三七皂苷R1和人参皂苷Re对照品各约5 mg，精密称定，分别置于50 ml量瓶中，加95 %乙醇定容至刻度，得对照品储备溶液；精密移取各对照品储备溶液100 μl，置于同一10 ml量瓶中，加95 %乙醇定容至刻度，即得混合对照品溶液（终浓度约为1 μg/ml）。

2.4 生物样本采集与前处理

2.4.1 血浆、尿液样本采集 给药前，采集空白血浆与尿液。受试者空腹口服三七极细粉2 g，适量温水送服，分别于0.5，1，1.5，2，4，6，12 h使用采血管于手静脉处采血2 ml，取血后4000 r/min、4 ℃下离心5 min，取上层血浆。此外，给药后收集1～4 h、4～8 h、8～12 h尿液，均保存于-80 ℃冰箱中备用。

2.4.2 生物样本前处理 血浆样本：取2.4.1项下空白血浆及各时间点含药血浆各100 μl，加300 μl甲醇沉淀蛋白，涡旋2 min，14 000 r/min、4 ℃下离心10 min，取上层清液，常温氮气吹干，加50 %甲醇100 μl复溶，涡旋混匀1 min，14 000 r/min、4 ℃下再次离心10 min，取上清，进样测定。尿液样本：取2.4.1项下空白尿液及给药后各时间段尿液各100 μl，加甲醇300 μl，涡旋2 min，14 000 r/min、4 ℃下离心10 min，取上层清液进样分析。

3 结果与分析

3.1 UHPLC Q-Exactive HRMS色谱特征分析

三七极细粉主要包含皂苷类成分，此外，尚含少量的黄酮苷类成分，为鉴定其详细的化学成分及其经人体口服给药后血液和尿液中吸收的成分及代谢产物，本研究将三七极细粉的提取物、给药后的血液与尿液3种样本经前处理后进样于UHPLC Q-Exactive HRMS系统，按2.1.2项下条件采集数据，最终得到不同样本的基峰强度（BPI）色谱图（见图1）。

图2 负离子模式下不同双糖链的裂解特征

3.2 三七极细粉提取物成分鉴定

基于UHPLC Q-Exactive HRMS准分子离子和加荷离子等信息，运用Xcalibur定性分析软件获得目标化合物的保留时间（tR）、精确相对分子质量及二级裂解碎片等质谱信息，对各色谱峰进行初步推测，并对比已知对照品质谱裂解数据及相关文献[8-9]，最终确定各色谱峰化合物结构。共鉴定出41各化合物，其中皂苷类成分38个，黄酮苷类成分3个。化合物及归属信息详见表1。

表1 三七极细粉醇提物化学成分鉴定结果

质谱分析中，关于糖链部分，2个六碳醛糖（如2个葡萄糖）或六碳醛糖与甲基五碳醛糖（如葡萄糖与鼠李糖）或六碳醛糖与五碳醛糖（如葡萄糖与阿拉伯糖或木糖）相连可在负离子模式下相应出现m/z221.07，205.07和191.06的离子峰；此外，葡萄糖主要裂解为m/z161.04，113.02，101.02，179.05等碎片离子。关于苷元部分，由于皂苷类成分的苷元四元环结构稳定，不易裂解产生二级碎片离子，然其C-17支链在强电压下可进行一定程度的裂解形成相应的碎片离子，可进一步确定化合物的结构。关于黄酮苷类成分，由于苷元具有逆迪尔斯-阿尔德（RDA）裂解特点，易于解析。本研究主要根据苷元结构差异进行初步分类，分别解析各色谱峰对应的化合物结构。

峰1：UHPLC Q-Exactive HRMS数据显示其保留时间为6.28 min，一级准分子离子为m/z625.1412，提示分子式为C27H30O17（[C27H30O17]-：计算值为625.1410）。准分子离子m/z625.1412中性丢失糖基（C12H22O10）产生碎片离子m/z300.0277，提示为二葡萄糖取代。其余碎片离子m/z271.0250，255.0299，243.0298和151.0022与槲皮素裂解碎片一致[8]。因此，推测峰1的结构为槲皮素-3-O-槐糖苷。此外，根据峰2的一级与二级质谱数据，同样推测出峰2的结构为山奈酚-3-O-β-D-半乳糖（6→1）β-D-葡萄糖苷。

峰3：在二级质谱图中，观察到甲基取代信号，其他碎片离子与槲皮素裂解碎片一致，再结合mzCloud数据库，推测出峰3的结构为7-甲基槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖（2→1）β-D-木糖苷。

峰7～9：高分辨质谱数据显示其一级准分子离子[M+HCOOH-H]-分别为m/z977.5331，845.4910和991.5501，其二级碎片中均可观察到中性丢失m/z46.01（HCOOH）的碎片离子，提示为母离子与甲酸的加和离子，因此其对应分子式分别为C47H80O18、C42H72O14和C48H82O18。在二级碎片离子中，均可观察到苷元离子m/z475.3787及其C-17支链断裂后形成的碎片离子m/z391.2861，提示均为原人参三醇型三萜皂苷。根据糖苷键连接位置不同及不同糖分子量差异等信息推测峰7～9的结构分别为三七皂苷R1、人参皂苷Rg1和人参皂苷Re。峰7～9的保留时间、一级及二级质谱碎片离子与对照物质三七皂苷R1、人参皂苷Rg1和人参皂苷Re相一致，进一步确证了峰7～9的结构。峰4～6、峰10～16、峰19及峰27的二级质谱数据中均存在苷元离子m/z475.38及其C-17支链断裂后形成的碎片离子m/z391.29，表明其苷元均为原人参三醇型三萜皂苷。根据糖苷键的裂解信息及文献数据[8]，推测峰4～6、峰10～16、峰19及峰27的结构见表1。

峰20：在二级质谱图中，观察到m/z459.3873和失去C-17支链的m/z375.2899碎片离子，提示为原人参二醇型皂苷，其保留时间、一级及二级碎片信息与人参皂苷Rb1对照品一致，因此推测峰20为人参皂苷Rb1。同样，峰17、18、峰21～24、峰26、峰28～34及峰38～40中均含m/z459.39和375.29的碎片离子，提示可能为原人参二醇型皂苷。再根据糖链断裂所产生的碎片离子并结合文献数据[8]，分别推测上述不同色谱峰的结构，见表1。

峰25、峰35～37及峰41，首先根据一级质谱中的离子信息推测该分子的元素组成，得分子式，然后以分子式在PubChem网络数据库中查询可能的化学结构，再结合文献数据最终确定对应化合物的结构，具体结果见表1。

3.3 生物样本原型及代谢物成分鉴定

通过与空白血浆、尿液进行比对，给药后在血浆和尿液样本中均未检测出各化学成分的原型及代谢产物。

4 结论

本研究通过采用UHPLC Q-Exactive HRMS技术对三七极细粉醇提物中的化学成分进行了系统研究，共鉴定了41个化合物，其中3个为黄酮苷，另38个为皂苷类成分。健康男性口服正常剂量后，在不同时间点或时间段内的尿液中均未检出原型及代谢物。究其原因，可能与以下三点因素有关：首先，可能由于人体常规口服剂量，吸收入血后不足以被检测到；其次，由于三七极细粉中的成分主要为皂苷类成分，在肠道上皮细胞及肠道菌群中被水解为极性较低的苷元，然后在肝脏中直接或代谢后经胆汁排出；此外，由于这些代谢后的苷元类成分极性较低，在血液中不能以游离形式存在，可能主要分布于相关组织或脏器之中。以上观点，后续需开展粪便成分检测、动物水平的胆汁排放实验或组织分布实验加以验证。

综上，本试验对三七极细粉醇提物中的化学成分进行了较为全面系统的质谱定性分析，同时对其人体口服吸收入血及尿液排泄情况进行了初步研究，可为后续全面的活性物质分析及定量指标控制研究奠定基础。