AHP-CRITIC法结合正交设计优化红黄丹酊提取工艺

吴作敏，于晓涛，王韵旨，宁 萌，王 瑞,2,3*

（1.漯河市中心医院 药学部，河南 漯河 462000；2.河南省中药制剂与加工中医药重点实验室，河南 漯河 462000；3.河南省中药制剂现代化技术研发与临床应用工程研究中心，河南 漯河 462000）

红黄丹方为临床经验方，由红花、大黄等12味药材组成，外用具有活血化瘀、消肿止痛的功效，临床用于瘀血肿痛、跌打损伤等软组织损伤的治疗，疗效确切。方中红花活血化瘀，大黄凉血止痛，共为君药。现代药理研究证实红花中的羟基红花黄色素A[1-2]和大黄中的芦荟大黄素、大黄酸等蒽醌类成分[3-5]均有抑制损伤组织中炎症因子表达、减轻细胞损伤、改善血液流变学、提高损伤局部痛阈、减轻损伤局部组织病理学变化的作用。目前该方采用饮片打粉，使用时加入一定浓度乙醇调配外敷而用，存在质量不易控制、透皮吸收差、使用不方便等缺点[6]。依据处方药味理化性质及临床使用情况，拟将此方开发为外用酊剂，提高制剂质量均一性及患者依从性。中药酊剂系指采用一定浓度的乙醇将中药饮片提取或溶解成澄清液体制剂，也可用浸流膏稀释制成，因其疗效显著且给药形式灵活，安全可靠性高被广泛应用于临床[6-7]。本研究利用层次分析-基于指标相关性混合加权法（AHPCRITIC）结合正交试验，以羟基红花黄色素A、大黄游离蒽醌类成分的提取率及总固体物得率为评价指标，优选红黄丹酊的提取工艺，以期为该方的后续研究提供参考。

1 仪器与材料

1.1 仪器

Agilent 1260高效液相色谱仪（美国Agilent公司），配置四元泵、自动进样器、柱温箱、VWD检测器、色谱工作站（美国Agilent公司）；Milli-Q型纯水机（美国Millipore公司）；AUW-120D型电子天平（日本岛津公司）；5810R型低温高速离心机（德国Eppendorf公司）；JA2003N型电子天平（上海精密仪器有限公司）。

1.2 试药

红花（批号：200201），大黄（批号：210801），牡丹皮（批号：201001）等14味中药饮片均购自河南鸿博药业有限公司，经河南省中药制剂与加工中医药重点实验室副主任药师于晓涛鉴定，质量均符合2020年版《中国药典》的要求；对照品羟基红花黄色素A（批号：DSTDQ001701，含量：98.98 %），芦荟大黄素（批号：DST190626-007，含量：98.00 %），大黄酸（批号：DST200819-029，含量：98.29 %），大黄素（批号：DST191112-030，含量：98.69 %），大黄酚（批号：DST200819-032，含量：98.67 %），大黄素甲醚（批号：DST200325-0312，含量：99.80%），均购自成都德思特生物技术有限公司；甲醇（色谱纯，德国默克公司）；磷酸（色谱纯，上海麦克林） ；乙醇（药用辅料级别，新乡市先丰医药新材料有限公司）。

2 方法与结果

2.1 指标成分的含量测定

采用高效液相色谱法（HPLC）测定。

2.1.1 色谱条件 Intertsil ODS-3 色谱柱（4.6 mm×150 mm，5 µm）；流动相：甲醇（A）-0.2 %磷酸（B），梯度洗脱（0～5 min，18 %～31 %A；5～15 min，31 %～36 %A；15～20 min，36 %～56 %A；20～35 min，56 %～60 %A；35～50 min，60 %～74 %A；50～65 min，74 %～80 %A；65～85 min，80 %～85 %A） ；检测波长403 nm（羟基红花黄色素A，0～20 min），254 nm（芦荟大黄素、大黄酸、大黄酚、大黄素、大黄素甲醚，20～85 min）；流速1.0 ml/min；柱温35 ℃；进样量10 µl。

2.1.2 溶液的制备

2.1.2.1 混合对照品溶液的制备 精密称取各对照品适量于量瓶中，加甲醇定容，得各对照品储备液，分别取适量对照品溶液混匀成混合对照品溶液（羟基红花黄色素A浓度2.34×10-2mg/ml，芦荟大黄素浓度4.28×10-3mg/ml，大黄素浓度4.32×10-3mg/ml，大黄酸浓度6.89×10-3mg/ml，大黄酚浓度1.38×10-2mg/ml，大黄素甲醚浓度4.49×10-3mg/ml）。

2.1.2.2 供试品溶液的制备 按处方比例称取中药饮片，除薄荷冰和冰片外，粉碎成粗粉，过2号筛，置有盖玻璃容器中，加入适量规定浓度的乙醇，搅拌均匀后静置，浸渍适当时间，过滤收集醇提液，取适量该醇提液溶解处方量的薄荷冰和冰片后，再次并入上述醇提液中，搅拌均匀，静置24 h，滤过，滤液添加原浓度的乙醇至规定量，分装，即得红黄丹方醇提液。精密量取红黄丹方醇提液适量，加50 %乙醇稀释10倍，12 000 r/min离心10 min，取上清，经0.45 µm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得供试品溶液。

2.1.2.3 阴性样品溶液的制备 分别称取缺红花、大黄的处方量药材各一份，按2.1.2.2项下方法制备两份阴性样品溶液。

2.1.3 专属性考察 取混合对照品溶液、供试品溶液及两种阴性样品溶液适量，按2.1.1项下色谱条件进样分析，色谱图见图1。由图1可见，供试品溶液与对照品溶液在相应位置有相同色谱峰，阴性样品溶液在对照品峰相应的位置上无干扰，表明方法专属性良好。

图1 红黄丹方中6种有效成分HPLC图谱

2.1.4 线性关系 精密吸取2.1.2项下混合对照品溶液2，4，6，8，10，15 µl，按2.1.1项下色谱条件进样测定。以峰面积为纵坐标（Y） ，进样量为横坐标（X） ，进行线性回归，得标准曲线，见表1。由表1可见，各成分在各自线性范围内线性关系良好。

表1 线性回归方程

2.1.5 精密度考察 精密吸取同一混合对照品溶液，按2.1.1项下色谱条件连续进样6次，测定峰面积。结果显示各指标性成分峰面积的RSD值分别为0.34 %（羟基红花黄色素A），0.63 %（芦荟大黄素），1.27 %（大黄酸）和1.44 %（大黄素），0.59 %（大黄酚），1.49 %（大黄素甲醚），表明仪器精密度良好。

2.1.6 重复性考察 取同一批次处方量药材6份，按2.1.2项下方法平行制备6份供试品溶液，按2.1.1项下色谱条件分别进样分析。测得各指标成分峰面积并计算含量，结果羟基红花黄色素A、芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚含量RSD分别为0.99 %，1.68 %，1.74 %，0.91 %，1.13 %，1.45 %，表明该方法重复性良好。

2.1.7 样品溶液稳定性考察 取同一供试品溶液，分别于0，2，4，8，12，24 h，按2.1.1项下色谱条件下进样10 µl检测，测得羟基红花黄色素A、芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚面积RSD分别为1.86 %，1.68 %，1.45 %，0.84 %，0.75 %，1.27 %，表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.1.8 加样回收率考察 精密吸取一定量已知各指标成分含量（羟基红花黄色素A、芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚含量分别为141.06，15.19，64.76，6.76，19.04，8.94 µg/ml）的红黄丹方醇提液，按2.1.2项下方法制得供试品溶液。取供试品溶液1 ml，均精密加入2.1.2项下混合对照品溶液1 ml，平行操作6份，按2.1.1项下色谱条件进样分析，计算回收率。结果，羟基红花黄色素A、芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚平均加样回收率分别为100.91 %，98.78 %，99.34 %，100.50 %，97.64 %，98.93 %，RSD分别为1.79 %，1.93 %，2.41 %，2.09 %，1.98 %，2.71 %。

2.2 总固体得率测定

精密量取各编号的红黄丹方醇提液3份，每份20 ml，置已干燥至恒重的蒸发皿中，水浴蒸干，105 ℃干燥3 h，转移至干燥器中，冷却30 min，迅速精密称定重量，按下式计算总固体得率及RSD值。

式中，W为20 ml红黄丹方醇提液的总固体质量，V为样品溶液总体积，M为中药饮片的质量。

2.3 正交试验设计与结果

参考文献[8-9]报道，并结合单因素预试验结果与实际生产要求，选取乙醇浓度（A）、加醇倍量（B）、浸渍时间（C）为考察因素，各因素水平见表2，以羟基红花黄色素A提取率（羟基红花黄色素A提取量/红花饮片质量）、大黄游离蒽醌提取率[（芦荟大黄素提取量+大黄酸提取量+大黄素提取量+大黄酚提取量+大黄素甲醚提取量）/大黄饮片质量]，及总固体得率综合评分为评价指标，设计L9（34）正交试验优选提取工艺，因素水平见表2，结果见表3。

表2 因素水平表

表3 正交试验设计与结果

2.4 指标权重的确定

2.4.1 层次分析法（AHP） AHP将定性分析与定量分析相结合，通过层次分析的方法建立成对比较的优先判断矩阵，赋予各项指标相对评分，并计算出各指标的权重比例[10-11]。本研究根据复方组方规律，结合文献[12]，将羟基红花黄色素A提取率、大黄游离蒽醌提取率、总固体得率3个指标分为2个层次，确定指标优先顺序为：羟基红花黄色素A提取率=大黄游离蒽醌提取率>总固体得率，构建优先矩阵见表4，借助在线分析软件SPSSAU软件（https://www.spssau.com）进行AHP层次分析，得出羟基红花黄色素A提取率、大黄游离蒽醌提取率、总固体得率的权重系数分别是0.42857，0.42857，0.14286，CR（一致性比例因子）=0＜0.10，说明了权重系数的有效性。

表4 判断矩阵评分

2.4.2 基于指标相关性的权重确定法（CRITIC）CRITIC是通过指标间相关性判断各个指标的重要性[13]，以评价指标间的对比强度及冲突性为基础来确定客观权重系数，充分考虑到各指标内的变异性及指标间的冲突性，由CRITIC法确定的权重系数与复方中各评价指标间的关联性和各样本间数据变异性密切相关[14-15]。首先将各评价指标数据按公式“指标归一化值=[（实测值-最小值）/（最大值-最小值）］×100 %”进行归一化处理，通过SPSSAU软件进行 CRITIC分析，得羟基红花黄色素A提取率、大黄游离蒽醌提取率、总固体得率权重系数分别为0.3272，0.3886，0.2842，其中大黄游离蒽醌提取率的权重系数最大，羟基红花黄色素A提取率次之。

2.4.3 AHP-CRITIC混合加权法 AHP法以主观评价为基础来确定各指标权重系数，CRITIC法则更为客观地反应各指标的权重系数。为更加真实地评价试验结果，兼顾主客观因素，本文将两种权重系数确定方法加以结合，根据公式ωAHP-CRITIC=ωAHPij×ωCRITICij/∑ωAHPijωCRITICij[16]，计算得羟基红花黄色素A、大黄游离蒽醌、总固体得率权重系数分别为0.4037，0.4794，0.1169。

2.4.4 权重评分的比较及确定 分别采用 AHP法、CRITIC法及AHP-CRITIC法对权重赋值后，对正交试验结果按以下公式计算综合评分（S）。

其中ω为指标权重，Y为指标数值，具体结果见表5。

表5 3种方法评分结果

直观分析可知3种评分方法给出的结果具有一致性，应用SPSS软件分别对综合评分与权重系数进行相关性分析。AHP法、CRITIC法与AHPCRITIC法综合评分相关系数分别为0.998，0.994，AHP法与CRITIC法综合评分相关系数为0.998，且相关性均极显著（P<0.01），表明3种权重赋值法给出的评分结果具有一致性；AHP法与CRITIC法权重系数的相关系数为0.811（P>0.05），说明两组相关系数相关性不显著，表明AHP法与CRITIC法给出的信息叠加性较差。AHP-CRITIC法整合主观与客观两方面因素进行评价，所展现的信息更加科学合理，因此选择AHP-CRITIC法进行综合权重评分。

2.5 提取工艺的确定

采用AHP-CRITIC法确定权重系数，对正交试验结果进行综合评分，并利用SPSS 19.0对正交试验结果进行分析，直观分析结果见表6，方差分析结果见表7。根据直观分析可知，3因素对综合评分的影响顺序为A>C>B，即乙醇浓度对综合评分影响最大，加醇倍量的影响最小；根据方差分析结果可知3个影响因素对指标成分含量及总固体得率均无显著影响，为节约工业生产时间与成本，选择最佳工艺为A1B1C2，即应用4倍量50 %乙醇浸渍10 d，其符合制剂生产方便、成本低等特点。

表6 直观分析结果

表7 方差分析结果

2.6 验证性试验

为验证正交试验结果的准确性，保证红黄丹酊制备工艺的合理性，称取处方量药材3份，按照最终确定的最佳工艺A1B1C2，进行3批验证试验，结果见表8，各指标的RSD值均小于3 %，说明A1B1C2工艺稳定可靠，可继续开展下一步研究。

表8 工艺验证结果

3 讨论

3.1 评价指标成分的选择

红黄丹方中的红花、牡丹皮等药材均含挥发性成分，加热会导致其挥发性成分的逸散损失，且大黄中的蒽醌类成分稳定性差，高温易分解，因此不宜采用加热的提取方式，且因大黄富含黏性成分（鞣质）等，不适合渗漉法提取[17]，因此最终选择浸渍法作为红黄丹酊剂的提取方法。根据前期预实验结果，提取次数增加，指标成分得率相对增加，但随着溶剂量的增加，指标成分浓度下降，且因复方中含挥发油成分及不稳定性活性成分，不宜加热浓缩以减少溶剂体积，为保证药物疗效，综合考虑，确定红黄丹方提取次数为1次。

中药复方一般通过多组分、多靶点、多通路的方式从整体上调节机体功能[18]，为更科学地体现工艺研究的合理性，本研究采用多组分综合评分的方法联合正交设计筛选工艺参数。由于羟基红花黄色素A、大黄游离蒽醌类成分分别为君药红花、大黄中具有化瘀止痛作用的主要药效成分[5,19]，总固体得率常作为中药酊剂研究的评价指标[20]，因此本研究以羟基红花黄色素A提取率、大黄游离蒽醌类成分提取率及总固体得率作为评价指标。

3.2 权重系数的确定

权重系数的确定是采用多指标进行综合评分筛选相关参数时，能否科学合理进行综合评分的重要环节[21]。AHP法将各指标按主观经验进行重要性排序并分层，其在一定程度上体现复方配伍规律，但缺乏与实际数据信息的结合；CRIRIC法则能客观分析实际数据信息，但缺少与不同指标间轻重关系的结合；AHP-CRIRIC混合加权法整合两种赋权方法的特点，既考虑到复方配伍及药效发挥特点，又客观分析了实际数据信息。经对比分析，本研究采用整合主观与客观因素为一体的AHP-CRIRIC混合加权法确定多指标权重系数，筛选出的最佳制备工艺为4倍量50 %乙醇浸渍10 d，且通过验证试验检验了该工艺的稳定可行性，为下一步研究提供数据支持。