液相色谱-串联质谱法测定牛肉汤中罂粟碱和那可丁含量的不确定度评定

作者简介：周勇（1985—），男，云南红河人，本科，工程师。研究方向：食品、化妆品及药品检验。

摘 要：探讨了液相色谱-串联质谱法测定牛肉汤中罂粟碱和那可丁含量的不确定度评价方法，根据测量不确定度的评定理论，分别对试验中的仪器和操作步骤的各个不确定度分量进行计算。当k=2时，牛肉汤中罂粟碱的含量为9.74 μg·kg-1，扩展不确定度为3.88 μg·kg-1；那可丁的含量为8.89 μg·kg-1，扩展不确定度为

2.62 μg·kg-1，其中标准曲线拟合和样品前处理阶段对不确定度影响最大。

关键词：牛肉汤；罂粟碱；那可丁；不确定度评定

Evaluation of Uncertainty in the Determination of Papaverine and Narcotine in Beef Soup by Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry

ZHOU Yong

（Honghe Inspection Institute for Food and Drug Control， Honghe 661199， China）

Abstract： Explored the uncertainty evaluation method for the determination of papaverine and narcotine content in beef soup using liquid chromatography tandem mass spectrometry. Based on the evaluation theory of measurement uncertainty， the uncertainty components of the instruments and operating steps in the experiment were calculated. When k=2， the papaverine content in beef soup was 9.74 μg·kg-1， with an expanded uncertainty of 3.88 μg·kg-1; the content of narcotine is 8.89 μg·kg-1， with an expanded uncertainty of 2.62 μg·kg-1， with the uncertainty of standard curve fitting and sample pre-treatment stage having the greatest impact.

Keywords： beef soup; papaverine; narcotine; uncertainty assessment

牛肉富含氨基酸、蛋白质、微量元素和矿物质，能提高机体免疫力、增强抗病能力，对儿童生长发育有一定的促进作用[1]。牛肉具有补脾胃、补养气血、补肝肾及强筋壮骨的作用。在云南省，牛肉米线深受人们喜爱，但一些商家为了商业利益，会在牛肉汤料中加入罂粟壳，使人体产生强烈的依赖性和鲜美的味觉感受。罂粟壳含有罂粟碱和那可丁等多种生物碱类物质，对人体健康具有毒害作用[2-3]。

本文依据《食品中吗啡、可待因、罂粟碱、那可丁和蒂巴因的测定》（BJS 201802）[4]测定牛肉汤中的罂粟碱、那可丁的含量，分别对试验中的仪器和操作步骤中的各个不确定度分量进行计算，通过合成得到牛肉汤中罂粟碱和那可丁含量的扩展不确定度，分析不确定度的最大影响分量，为评价检测结果提供参考[5-6]。

1 材料与方法

1.1 仪器和标准品

AB QTRAP4500+Thermo U3000液质联用仪（正离子监测模式：Urel=11%，k=2）；LA-612纯水机（英国埃尔格）；SK5210HP超声波清洗器（上海科导超声）；SH1850R高速冷冻离心机（湖南湘仪）；Vortex Genie 2涡旋振荡器（美国Scientific Industries）；MS204TS/02電子天平（梅特勒-托利多）。

100 μg·mL-1甲醇中盐酸罂粟碱（以罂粟碱计），不确定度3%（k=2），坛墨质检；100 μg·mL-1甲醇中盐酸那可丁（以那可丁计），不确定度3%（k=2），坛墨质检。

1.2 试验方法

1.2.1 样品前处理

准确称取试样2 g（精确至0.01 g）于离心管中，加入2 mL水，涡旋振荡30 s，加入15 mL乙腈，涡旋振荡1 min，超声提取30 min，再加入6 g无水硫酸镁和1.5 g无水醋酸钠，立即涡旋振荡2 min，使样品吸附其中的水分，4 000 r·min-1离心5 min，取上清液过有机相滤膜（0.22 μm），准确量取滤液

1 mL至20 mL容量瓶中，用乙腈稀释至刻度，摇匀，进样[4]。

1.2.2 标准溶液的配制

分别准确吸取0.1 mL 100 μg·mL-1甲醇中盐酸罂粟碱（以罂粟碱计）和0.1 mL 100 μg·mL-1甲醇中盐酸那可丁（以那可丁计）于同一10 mL容量瓶中，乙腈定容，摇匀，得到1.0 μg·mL-1的罂粟碱和那可丁混合标准中间溶液。再准确吸取1.0 mL混合标准中间溶液于100 mL容量瓶中，乙腈定容，摇匀，得到

0.01 μg·mL-1的罂粟碱和那可丁混合标准使用溶液。分别准确吸取0.1 mL、0.2 mL、0.4 mL、1.0 mL、

2.0 mL和4.0 mL混合标准使用溶液于20 mL容量瓶中，乙腈定容，摇匀，得到质量浓度分别为

0.05 ng·mL-1，0.10 ng·mL-1，0.20 ng·mL-1，0.50 ng·mL-1，1.00 ng·mL-1和2.00 ng·mL-1的罂粟碱、那可丁混合标准工作溶液[4]。

1.2.3 色谱与质谱条件

（1）色谱条件。色谱柱：Waters BEH HILIC色谱柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）；进样量：5 μL；柱温：35 ℃；梯度程序见表1。

（2）质谱条件。扫描方式：正离子扫描；检测方

式：多反应监测；气帘气：40 psi；喷雾气：50 psi；辅助加热气：50 psi；离子化电压：5 500 V；温度

500 ℃，碰撞气：Medium；其他参数见表2。

2 不确定度数学模型

以标准工作溶液的浓度为横坐标，色谱峰面积为纵坐标，绘制标准工作曲线。采用外标法定量，样品中的罂粟碱和那可丁含量的计算公式为

（1）

式中：X为牛肉汤中各罂粟碱或那可丁的含量，μg·kg-1；C为由标准曲线得出试样溶液中各待测物的浓度，ng·mL-1；V为试样提取液的体积，此处为15 mL；

m为样品的质量，g；f为稀释倍数，此处为20。

3 不确定度来源分析

根据标准方法和数学模型，影响罂粟碱和那可丁含量的不确定度分量主要由样品前处理引入、标准物质引入、标准曲线拟合引入、回收率引入及样品测量重复性引入。罂粟碱和那可丁含量的不确定度来源鱼骨图见图1。

4 不确定度分类的计算

4.1 样品前处理过程引入的测量不确定度

4.1.1 称量引入的相对标准不确定度

（1）天平示值误差引入的相对标准不确定度。检定证书中允许误差限为0.1 g。样品称量2次，作为平行样，按照均匀分布计算（k=），引入的标准不确定度。天平示值2.00 g的样品，示值误差引入的相对标准不确定度为

（2）天平的偏载误差引入的相对标准不确定度。检定证书中偏载允许误差限为0.2 g，称量2次，标准不确定度，天平示值

2.00 g的样品，分析天平的偏载误差引入的相对标准不确定度为

因此，分析天平称量引入的相对标准不确定度为

4.1.2 样品前处理过程移液管和容量瓶引入的测量不确定度

按照《常用玻璃量器检定规程》（JJG 196—2006）[7]的规定，假设为均匀分布，则样品前处理过程中移液管和容量瓶引入的不确定度见表3。合成相对标准不确定度为

4.1.3 样品前处理过程引入的相对标准不确定度

将各分量进行合成，样品前处理过程引入的测量不确定度为

4.2 标准物质引入的不确定度

4.2.1 标准物质纯度引入的相对标准不确定度

根据标准物质证书得到甲醇中盐酸罂粟碱（以罂粟碱计），浓度为100 μg·mL-1，不确定度3%（k=2），则罂粟碱标准使用溶液引入的相对标准不确定度为；甲醇中盐酸那可丁（以那可丁计），浓度为100 μg·mL-1，不确定度3%（k=2），则那可丁标准使用溶液引入的相对标准不确定度为

4.2.2 标准溶液配制引入的相对标准不确定度

按照《常用玻璃量器检定规程》（JJG 196—2006）[7]的规定，假设均匀分布，标准溶液稀释过程中玻璃量器引入的不确定度见表4。合成相对标准不确定度为

4.2.3 标准工作曲线配制引入的相对标准不确定度

按照《常用玻璃量器检定规程》（JJG 196—2006）[7]的规定，假设均匀分布，标准工作曲线配制过程中玻璃量器引入的不确定度见表5。合成相对标准不确定度为

4.2.4 标准物质引入的相对标准不确定度的合成

将上述各分量进行合成，则标准物质罂粟碱和那可丁引入的相对标准不确定度均为

urel（s）=

4.3 標准曲线拟合引入的不确定度

将罂粟碱、那可丁标准曲线拟合方程，分别计算标准曲线的残余残差标准差和样品含量标准偏差。

标准曲线残余残差公式为

（2）

式中：n为标准点数量；a为线性方程的斜率；b为线性方程的截距；xi为校准曲线各浓度点的浓度，ng·mL-1；yi为校准曲线各浓度点相应组分的峰面积，则样品含量标准偏差公式为

（3）

式中：n为浓度点数（自由度取n-2）；p为被测物测量平行次数；为标准曲线浓度平均值，ng·mL-1；为被测物测量平均值，ng·mL-1。

标准曲线拟合引入的相对标准不确定度为

（4）

试验中样品测量的平行次数为2次，罂粟碱的信号强度为10 515、10 637；那可丁的信号强度为

5 402、5 476。带入公式（3）和公式（4）后，罂粟碱和那可丁的标准曲线的残余残差和样品含量标准偏差及相对标准不确定度见表6。标准曲线拟合引入的相对标准不确定度分别为

urel（C1）=0.167；urel（C2）=0.098 4

4.4 回收率引入的不确定度

在空白样品中加标后得到罂粟碱和那可丁加标水平为18 μg·kg-1的加标样品，进样6次得到回收率测定结果为罂粟碱86%、84%、85%、82%、81%、80%，平均回收率为R=83%，标准偏差为S=2.37%；那可丁82%、80%、87%、82%、78%、79%，平均回收率为R=81%，标准偏差为S=3.20%

罂粟碱回收率引入的相对标准不确定度为

那可丁回收率引入的相对标准不确定度为

4.5 样品测量重复性引入的相对标准不确定度

试验中，对样品重复测定3次，代入公式（5）计算。

（5）

式中：S为样品含量的标准偏差，μg·kg-1；为样品中各待测物的含量，μg·kg-1。

样品中罂粟碱的3次测定结果为9.69 μg·kg-1、9.80 μg·kg-1、9.74 μg·kg-1，则平均含量为9.74 μg·kg-1，标准偏差为0.055 1 μg·kg-1，则样品中罂粟碱的相对标准不确定度为urel（r1）=0.003 27。

样品中那可丁的3次测定结果为8.82 μg·kg-1，

8.94 μg·kg-1，8.90 μg·kg-1，则平均含量为

8.89 μg·kg-1，标准偏差为0.061 1 μg·kg-1，则样品中那可丁的相对标准不确定度为urel（r2）=0.003 97。

5 合成不确定度和扩展不确定度

5.1 合成不确定度

把上述各分量代入计算合成不确定度，罂粟碱结果的合成相对标准不确定度为

那可丁测量结果的合成相对标准不确定度为

合成不确定度为罂粟碱：u=9.74×0.199=

1.94 μg·kg-1；那可丁：u=8.89×0.147=1.31 μg·kg-1。

5.2 扩展不确定度

取包含因子k=2，液相色谱-串联质谱法测定牛肉汤中罂粟碱的含量为9.74 μg·kg-1，扩展不确定度为U=2×1.94=3.88 μg·kg-1；那可丁的含量为8.89 μg·kg-1，扩展不确定度为U=2×1.31=2.62 μg·kg-1。因此，牛肉汤中罂粟碱的测定结果为（9.74±3.88） μg·kg-1，那可丁的测定结果为（8.89±2.62） μg·kg-1，k=2。

6 结论

本实验对液相色谱-串联质谱法测定牛肉汤中罂粟碱和那可丁含量的测量不确定度来源进行分析和评定，发现标准曲线拟合和样品前處理阶段引入的不确定度影响最大，其他不确定度分量引入的相对不确定度影响较小。标准曲线拟合产生的不确定度分量影响较大，可能是一元线性拟合的局限性导致的，分析时可尝试二次拟合计算待测组分的浓度，同时可调整标准曲线的浓度范围，使其更适合待测组分的浓度检测。可选择经检定确认后，性能指标更优秀的天平来进行样品的测量。测量不确定度可给出结果的可信度和置信区间。可通过测量不确定度的计算来衡量检验结果，特别是检验结果处于检出限或者定量限等临界值时，具有重要的意义。更加全面和细化地考虑不确定度的来源，可提高测量结果的准确度。

参考文献

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[6]中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局，中国国家标准化管理委员会.化学分析方法验证确认和内部质量控制实施指南 色谱分析：GB/T 35655—2017[S].北京：中国标准出版社，2017.

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