新生儿缺氧缺血性脑病血清miR-124与miR-126的表达及临床意义

王岳斌 刘珍凤 李利香 吴晓青 苏 维

1）湘南学院附属医院，湖南 郴州423000 2）湘南学院临床学院，湖南 郴州423000

新生儿缺氧缺血性脑病（hypoxic-ischemic encephalopathy，HIE）是围生期急性缺血、缺氧所致的中枢神经系统疾病，中国新生儿HIE 发病率（3～6）/1 000人［1-2］。目前以亚低温为主的综合治疗仍是新生儿HIE 首选治疗策略，但重度HIE 患儿预后依然较差［3-4］，因此，早期诊断新生儿HIE对改善预后非常重要。神经元凋亡是新生儿HIE发生发展的重要机制［5-6］。研究表明，微小核糖核酸（microRNA，miRNA）能通过调控多种靶基因参与新生儿HIE 神经元凋亡调控［7-8］。miR-124、miR-126 是两种常见的miRNA，实验发现miR-124、miR-126能通过下调凋亡蛋白表达抑制脑缺血大鼠神经细胞凋亡［9-10］。Wei等［11］通过RNA 测序发现miR-124、miR-126 在HIE 后脑内低表达。本研究拟检测新生儿HIE 血清miR-124、miR-126水平，分析二者在新生儿HIE诊断中的价值及与病情的关系，以期为新生儿HIE 诊治提供新的途径。

1 资料与方法

1.1 一般资料选取2019-01—2023-02 湘南学院附属医院收治的92 例HIE 患儿为HIE 组，女30 例，男62 例；胎龄37～42（39.25±1.51）周；分娩方式：顺产28 例，剖宫产64 例；出生体质量2 241.5～4 154.6（3 583.71±275.46）g。根据病情严重程度（改良Sarnat 标准［12］）将HIE 患儿分为轻度组44 例，中度组27例，重度组21例。纳入标准：（1）足月新生儿；（2）HIE符合《新生儿缺氧缺血性脑病诊断标准》［13］；（3）患儿家属或监护人知情同意。排除标准：（1）先天性神经发育障碍者；（2）合并严重脏器损害者；（3）窒息、高胆红素血症、宫内感染、脑发育不良等其他原因所致脑损伤者；（4）合并感染者。另选取同期31名健康新生儿为对照组，女10例，男21例；胎龄37～42（39.20±1.44）周；分娩方式：顺产9 例，剖宫产22 例；出生体质量2 341.5～4 120.8（3 541.45±286.40）g。2组新生儿一般资料具有可比性（P＞0.05）。本研究经医院伦理委员会批准。

1.2 方法收集所有新生儿出生1 h 内股静脉血，离心半径10 cm，3 000 r/min离心15 min留取上层血清，部分血清通过Trizol 试剂盒（沈阳万类生物科技有限公司，编号：WLA088a）提取血清总RNA，微量分光光度计（武汉艾维斯特科技有限公司，型号：Nano-300）鉴定RNA 浓度和纯度合格后，使用反转录试剂盒（广州东盛生物科技有限公司，编号：R1011）合成cDNA。反转录条件：37 ℃1 h，80 ℃5 s。按实时荧光定量试剂盒（南京诺唯赞生物科技股份有限公司，编号：R223-01）进行实时荧光定量聚合酶链式反应。反应体系：共20 μL：cDNA 1 μL，正反向引物各0.5 μ L，2×TransStart®Top Green qPCR SurperMix 10 μL，无核酸酶水8.5 μL；反应条件：95 ℃90 s（1次），95 ℃30 s，63 ℃30 s，72 ℃15 s（循环40次）。以U6 为内参，2-ΔΔCT法计算血清miR-124、miR-126 相对表达量。miR-124 正向引物5′-CCTGAGCGGCAGATCAACC-3′，反 向 引 物5′-AGGTAGATCATGCCATACTCTCG-3′；miR-126 正 向 引 物5′-CAGGTCCAAAGGGTGAAC-3′，反向引物5′-GTAGACCAACTCCAGGCT-3′；U6 正 向 引 物5′-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3′，反向引物5′-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3′。剩余部分血清采用酶联免疫吸附法检测S100钙结合蛋白B（S100B）、神经元特异性烯醇化酶（NSE）水平。

1.3 统计学方法应用SPSS 28.0 统计学软件处理数据。计量资料2 组间比较采取t 或U 检验，多组间比较采取F检验或H检验，组内两两比较采取LSD或U 检验，以±s 或M（P25，P75）表示；HIE 患儿血清miR-124、miR-126 表达与S100B、NSE 水平的相关性采用Spearman 相关性分析；血清miR-124、miR-126水平对新生儿HIE的诊断价值采用受试者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲线分析；P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 2组患儿血清miR-124、miR-126、S100B、NSE水平比较HIE组血清miR-124、miR-126表达低于对照组，S100B、NSE水平高于对照组（P＜0.05）。见表1。

表1 2组患儿血清miR-124、miR-126、S100B、NSE水平比较Table 1 Comparison of serum miR-124，miR-126，S100B and NSE levels between the two groups

2.2 不同病情程度HIE 患儿血清miR-124、miR-126、S100B、NSE 水平比较轻度组、中度组、重度组血清miR-124、miR-126 表达依次降低，S100B、NSE水平依次升高（P＜0.05）。见表2。

表2 不同病情程度HIE患儿血清miR-124、miR-126、S100B、NSE水平比较Table 2 Comparison of serum miR-124，miR-126，S100B and NSE levels in children with different degrees of HIE

2.3 HIE 患儿血清miR-124、miR-126 表达与S100B、NSE水平的相关性Spearman相关性分析显示，HIE 患儿血清miR-124、miR-126 表达与S100B、NSE水平呈负相关（P＜0.05）。见表3。

表3 HIE患儿血清miR-124、miR-126表达与S100B、NSE水平的相关性Table 3 Correlation between serum miR-124，miR-126 expressions and S100B，NSE levels in children with HIE

2.4 血清miR-124、miR-126 水平对新生儿HIE 的诊断价值ROC 曲线分析显示，血清miR-124、miR-126 表达单独和联合诊断新生儿HIE 的曲线下面 积（area under the curve，AUC）分 别 为0.872、0.882、0.946。见表4和图1。

图1 血清miR-124、miR-126 水平诊断新生儿HIE 的ROC曲线Figure 1 ROC curve of serum miR-124 and miR-126 levels for the diagnosis of neonatal HIE

表4 血清miR-124、miR-126水平对新生儿HIE的诊断价值Table 4 Diagnostic value of serum miR-124 and miR-126 levels in neonatal HIE

3 讨论

新生儿HIE 是围生期多种因素引起脑组织缺血、缺氧而导致的脑损害，目前除传统“三支持”和“三对症”疗法外，亚低温也被广泛用于新生儿HIE治疗，且随着亚低温治疗方案不断优化，新生儿HIE病死率和存活患儿脑瘫、神经发育结局不良发生率显著降低［14-15］。亚低温治疗仅对轻中度HIE 具有较好疗效，对重度HIE的疗效有限，部分重度HIE患儿在亚低温治疗后遗留严重神经系统并发症或仍存在死亡风险［16-18］。早期诊断新生儿HIE 是改善患儿预后的重要措施，目前HIE 的诊断主要依赖临床观察和磁共振成像、计算机断层扫描，但具有一定滞后性［19-20］。S100B 和NSE 等神经细胞损伤标志物虽对新生儿HIE 诊断具有一定价值，但敏感度或特异度有限［21-22］。因此，寻找新的生物标志物以提升新生儿HIE诊断率很有必要。

新生儿HIE发病是多因素、多环节的病理过程，主要是炎症反应、氧化应激、神经毒性等相互作用引起神经细胞凋亡所致［23］。miRNA是一类长度为18～24 个核苷酸的非编码RNA，能通过引发信使核糖核酸的降解或转录后基因沉默，通过调控神经炎症反应、氧化应激、神经毒性和凋亡参与新生儿HIE 发生、发展，且miRNA 在体液中稳定，易从血清样本中检测到［24］。miR-124是脑细胞表达最多的miRNA之一，最初研究认为其可作为巨噬细胞极化的调节因子，将小胶质细胞从促炎型转换为抗炎型，抑制神经系统炎症反应，因此被认为是神经细胞保护因子［25］。近年研究发现miR-124 还能通过抑制神经细胞凋亡发挥神经保护作用，如miR-124能抑制丝裂原活化蛋白激酶/细胞外调节蛋白激酶1/2信号通路激活，减少脑梗死大鼠神经细胞凋亡［26］，还能通过抑制无名指蛋白38 表达，减少大脑中动脉阻塞大鼠神经细胞凋亡，增加神经元活性［27］。miR-126也是脑细胞高度表达的一种miRNA，特别是在脑血管内皮中，因此，既往研究多集中于其与脑血管功能的关系，近年研究发现miR-126 也可通过影响脑血管功能调控神经细胞存活［28］。Wang 等［29］研究报道，上调miR-126 能改善脑血管功能，抑制神经细胞凋亡和（或）坏死，促进神经元的生长。Gao等［30］研究报道，抑制miR-126表达能激活核因子κB信号通路，诱导凋亡基因产生，促进大鼠脑梗死后神经细胞凋亡。在脑缺血大鼠模型中，上调miR-126 能激活哺乳动物雷帕霉素靶蛋白/缺氧诱导因子-1α通路，促进脑血管生成，以抑制神经 细 胞 凋 亡［31］。最 近Wei 等［11］发 现miR-124、miR-126 在新生儿HIE 脑内低表达。目前关于血清miR-124、miR-126 表达对新生儿HIE 临床意义的研究报道有限。

S100B 和NSE 是重要的神经细胞损伤标志物，S100B升高能引起直接神经毒性作用，导致神经细胞凋亡，NSE 则是神经细胞凋亡后由神经元胞体内释放到细胞外的糖酵解酶，其浓度与HIE 患儿神经损伤程度密切相关［32-33］。本研究中HIE 患儿血清S100B、NSE水平升高，随着病情加重而升高，符合新生儿HIE脑损伤变化过程。本研究显示，HIE患儿血清miR-124、miR-126 表达随着病情加重而降低且低于对照组，说明血清miR-124、miR-126低表达参与新生儿HIE 发生、发展。同时，HIE 患儿血清miR-124、miR-126表达与S100B、NSE水平呈负相关，提示血清miR-124、miR-126 低表达可能通过引起和加重神经细胞损伤参与新生儿HIE 发生、发展。分析原因可能是血清miR-124 表达降低导致抑制细胞凋亡的信号转导和转录激活子3信号通路失活，使凋亡蛋白大量表达，诱导神经细胞凋亡，导致新生儿HIE。同时，随着miR-124表达进一步降低，神经细胞凋亡增加导致病情加重［34］。血清miR-124 表达降低可导致血管内皮生长因子大量表达，增加脑血管内皮通透性引起血管功能障碍，使脑组织缺血、缺氧而激活凋亡蛋白表达，进而导致新生儿HIE。伴随miR-126表达进一步降低，脑血管功能进一步加重，释放更多的凋亡蛋白加重新生儿HIE［35］。通过绘制ROC 曲线发现，血清miR-124表达为0.76时，诊断新生儿HIE的AUC为0.872；血清miR-126 表达为1.12 时，诊断新生儿HIE 的AUC 为0.882；血清miR-124、miR-126 表达联合诊断新生儿HIE 的AUC 为0.946，大于miR-124、miR-126 单独诊断，说明血清miR-124、miR-126 表达有助于新生儿HIE 诊断，且联合检测血清miR-124、miR-126表达能提升诊断价值。

新生儿HIE血清miR-124、miR-126低表达，与病情严重程度相关，可能通过神经细胞损伤参与新生儿HIE过程，血清miR-124、miR-126联合诊断新生儿HIE的价值较高。