生乳中黄曲霉毒素M1快速检测方法的比对

李 婕，曹学思，杨爱君，何 瑛，纪坤发，罗少杰

广东燕塘乳业股份有限公司，广东广州 510000

0 引言

黄曲霉毒素（Aflatoxin，AF）是迄今发现污染农产品毒力最强的一类生物毒素[1]。常见的有AFB1、AFB2、AFG1、AFG2，其中AFB1的含量与毒力最大[2]。黄曲霉毒素B1通常存在于花生、玉米、坚果等农副产品中[3]。黄曲霉毒素M1是黄曲霉毒素B1的4-羟基衍生物[2]。它是动物在摄入被黄曲霉毒素B1污染的饲料和食品后在体内产生的代谢物[4]，可致癌、致畸、致突变，其结构为二呋喃环和香豆素，溶于多种有机试剂，如氯仿、乙腈和甲醇等[5，6]，存在于动物分泌的乳汁和尿液中。牛乳是受黄曲霉毒素M1污染风险程度较高的食品之一。为保证安全卫生，各国都制定了严格限量标准：美国食品药品监督管理局（FDA）规定牛乳中黄曲霉毒素M1的限量水平为0.5 μg/kg，我国也规定牛乳中黄曲霉毒素M1含量不得超过0.5 μg/kg[7]。运用简易、便捷、快速、准确且适用的检测方法，测定牛生乳中黄曲霉毒素M1的污染状况，对乳品企业在日常生乳验收、乳品生产制造的过程中，能更好维护产品质量，保障消费者食品安全，具有重要意义。

目前测定牛乳中黄曲霉毒素M1残留量的方法有：色谱法、免疫化学法、光电化学法、光电发光法等。这些方法操作复杂繁琐、耗时长，或所需检测设备昂贵，均不利于乳品企业快节奏的生乳验收。而黄曲霉毒素M1胶体金快速检测试纸条法是一种利用胶体金免疫层析技术的新型检测方法，操作过程简易、耗时短、成本低、检出限符合国家标准，且特异性、灵敏度强，干扰性小，能较好满足乳品企业快节奏的生乳验收及成品奶检测需求。本文采用黄曲霉毒素M1胶体金快速检测试纸条法和ELISA检测试剂盒法做比对试验，验证胶体金快速检测试纸条法对不同加标浓度检测结果的重现性，验证该法的结果稳定性，并检验该法结果报阳的样品浓度。同时，检测ELISA检测试剂盒法检测结果的重现性、回收率和RSD值，验证该法检测结果的稳定性、准确度和精密度，并验证2 种方法检测结果的一致性，证实2 种方法联合使用测定生乳中黄曲霉毒素M1残留量的可行性，为乳品企业进行快速生乳验收提供数据参考。

1 材料与方法

1.1 试剂

RomerLabs黄曲霉毒素M1ELISA检测试剂盒，易瑞黄曲霉毒素M1胶体金快速检测试纸条。

1.2 仪器和设备

SIGMA离心机、Thermo酶标仪、BIOEASY金属浴热器、BIOEASY-SAFF Reader 02型胶体金试纸条读数仪、BRAND 8道移液器、BRAND单道移液器、CRYSTAL漩涡振荡器等。

2 检测原理

黄曲霉毒素M1胶体金快速检测试纸条法的检测原理：样品溶液中黄曲霉毒素M1与胶体金标记的黄曲霉毒素M1抗体相结合，封闭胶体金标记黄曲霉毒素M1抗体上的黄曲霉毒素M1抗原结合位点，阻止胶体金标记黄曲霉毒素M1抗体与纤维素膜上检验区中黄曲霉毒素M1蛋白偶联物结合，使之显色较弱，甚至不显色；反之，如样品溶液中没有黄曲霉毒素M1，则不能阻止胶体金标记黄曲霉毒素M1抗体与纤维素膜上检测区中黄曲霉毒素M1蛋白偶联物结合，显色较强。

黄曲霉毒素M1E L I S A 检测试剂盒法的检测原理：试剂盒应用直接竞争酶联免疫吸附原理。样品中黄曲霉毒素M1或标准品与酶-黄曲霉毒素M1偶合物中黄曲霉毒素M1竞争结合微孔中特异抗体，经洗板去除未参加抗原-抗体反应的黄曲霉毒素M1，加入底物液，颜色变蓝。再加入反应终止液，反应液颜色由蓝转黄。在450 nm（OD450 nm）滤镜及630 nm示差滤镜下使用酶标仪对微孔板进行吸光度值测量。利用标准品的吸光度值对标准品浓度制作标准曲线，将样品吸光度值与标准品吸光度值比较判读结果。

本文对生乳样品进行0.1 、0.2 、0.3 、0.4和0.5 μg/kg加标，用胶体金快速检测试纸条做平行检测，查看检测结果，以及试纸条在哪个残留浓度会报阳反应，再用ELISA检测试剂盒对各加标样进行平行定量试验，查看检测结果的重现性，验证检测结果的稳定性，并计算结果的回收率与RSD值，验证其检验结果的准确度和精密度，比较2 种方法检测结果的呼应程度，验证两法联用模式是否可行。

3 试验步骤

3.1 黄曲霉毒素M1 胶体金快速检测试纸条法检测步骤

（1）取200 μL奶样加入红色试剂微孔中，抽吸5～10 次直至微孔试剂混合均匀；

（2）（40±2）℃温育3 min；

（3）将试纸条插入红色试剂微孔中；

（4）（40±2）℃温育4 min；

（5）结果判读见图1，即阴性结果R＞1.1；弱阳性结果0.9≤R≤1.1；阳性结果R＜0.9；R值＝T/C。

图1 仪器结果判读示意图

3.2 黄曲霉毒素M1 ELISA 检测试剂盒使用方法

3.2.1 样品前处理

（1）移液器吸取10 mL生乳到试管中，4 ℃静置30 min；

（2）3 000 r/min加速度下将样品离心10 min；

（3）离心样品脂肪层下取0.4 mL去脂样品，与0.1 mL 100%甲醇混合；

（4）准备用于ELISA检测。

3.2.2 检测步骤

使用前，所有试剂及试剂盒内材料需恢复至室温。

（1）将适量标记颜色的稀释孔条放入微孔板架，使每个标准品或样品对应一个稀释孔。

（2）将等量有抗体包被的微孔条放入微孔板架。

（3）按240 μL/孔或2 mL/条用量体积，从酶联偶合物试剂瓶中量取所需试剂至试剂槽。使用8 道移液器移取200 μL酶联偶合物至每个稀释孔中。

（4）使用单道移液器，分别移取100 μL标准品和样品，至已装200 μL酶联偶合物的稀释孔中，反复吹吸3 次以上混匀溶液，最后将吸头中液体排空。每移取1 个标准品或样品时，必须换上新吸头。使用换有全新吸头的8 道移液器，快速移取每个稀释孔中液体各1 0 0 μ L，至相应有抗体包被的微孔中。室温下放置6 0 min。过程中不可摇动微孔板，以免引起孔与孔之间液体污染。

（5）60 min后，将孔中液体甩入水槽，用稀释后的冲洗缓冲液冲洗各孔，然后将微孔中的水甩入水槽中，重复5 次。冲洗后，将吸水纸巾放置在桌面上，使微孔板倒置扣击纸面，尽可能将残留水分排出。擦干微孔板底反面的水珠。

（6）按120 μL/孔或1 mL/条用量体积，从底物试剂瓶内量取所需底物液至试剂槽，使用8 道移液器移取100 μL底物至每个微孔中，避光室温下放置20 min。

（7）20 min后，按照120 μL/孔或1 mL/条用量体积，从终止液试剂瓶内量取所需终止液至1 个试剂槽中，使用8 道移液器依序向每个微孔加入100 μL终止液终止反应。微孔颜色应由蓝变黄。

（8）用酶标仪在450 nm滤镜及示差滤镜630 nm下读取结果，记录每个微孔的吸光度OD值。

（9）结果判读：通过计算软件快速得检测结果，0 ng/kg标准品OD值需＞0.5，否则说明试剂失效。使用软件计算结果时，其标准品曲线的线性相关系数（R）需为-1.000～-0.990。

4 仪器预热及校准

4.1 仪器预热

开启酶标仪、金属浴热器、胶体金试剂条读数仪，预热30 min。

4.2 胶体金试剂条读数仪校准

读取校准纸条得读数0.9 3 及0.9 5，符合0.90±0.10的仪器校准要求，读数仪性能正常。

5 结果与分析

5.1 胶体金快速检测试纸条对不同浓度黄曲霉毒素M1 奶样的检测结果

由表1可知，胶体金快速检测试纸条在样品加标浓度为0.2 μg/kg时开始报阳，远低于GB/T2761—2017《食品安全国家标准 食品中真菌毒素限量》中0.5 μg/kg的要求，具有较好的初筛价值。

表1 胶体金快速检测试纸条对不同浓度黄曲霉毒素M1 奶样的检测结果

5.2 ELISA 检测试剂盒对不同浓度黄曲霉毒素M1 奶样的检测结果

黄曲霉毒素M1ELISA检测试剂盒标样曲线线性相关系数R=-0.997 0。标准品0 μg/kg的OD值读数1.992，符合说明书-1.000≤R≤-0.990范围、标准品（0 μg/kg）吸光度值不低于0.5的检测要求。具体曲线见图2。该法检测结果重现性与稳定性结果见表2，其检测回收率在94.83%～100.53%之间，满足GB/T 27404—2008《实验室质量控制规范食品理化检测》中要求的60%～120%范围，检测结果准确度较高。RSD值在1.11%～3.01%之间，检测结果的精密度较好。

表2 样品重现性及回收率测定结果（n=6）

图2 黄曲霉毒素M1 ELISA 检测试剂盒的检测曲线结果（R ＝-0.997 0）

6 结论

本文采用ELISA检测试剂盒法和胶体金快速检测试纸条法对添加了不同浓度黄曲霉素M1的生乳样品进行比对检测。结果表明：胶体金快速检测试纸条法对含有不同浓度黄曲霉毒素M1生乳样品的测定结果呈现出一定梯度效应，并在残留量0.2 μg/kg时显示R＜0.9阳性结果，远低于GB/T 2761—2017《食品安全国家标准 食品中真菌毒素限量》中要求0.5 μg/kg水平，有较好的重现性。其操作方便，检测所需设备投入少，能耗低，耗时短（7 min），具有较好定性初筛检测价值。

黄曲霉毒素M1ELISA检测试剂盒在比对试验中，能与胶体金快速检测试纸条的检测结果呼应，且结果的重现性好，准确度和精密度高，具有较好定量检测价值。

本文讨论的2 种黄曲霉毒素M1检测法操作方便快捷，耗时短，结果有一定的准确度、精密度和重现性。使用胶体金快速检测试纸条对生乳中黄曲霉毒素M1残留量定性初筛，发现试纸条结果报阳时，再利用ELISA检测试剂盒定量试验的联合检测模式，对乳品企业进行生乳中黄曲霉毒素M1残留量的快速筛查，有一定基础参考价值。