加利地韦对狂犬病病毒体外抑制作用研究

谢 渊,迟瑛琳,陶晓燕,于鹏程,刘 茜,刘淑清,朱武洋

狂犬病是由狂犬病病毒(rabies virus,RABV)引起的一种以恐水恐风、咽肌痉挛、进行性瘫痪等为特征的高致死性的人兽共患病[1]。目前狂犬病已在150多个国家被发现,每年报道人狂犬病死亡数居高不下,严重危害人类健康。RABV可在哺乳动物间循环传播且可感染人类,一旦出现临床症状将导致不可逆转的死亡[2-4]。截至目前,仍然缺乏有效的狂犬病治疗方案和抗病毒药物,传统的密尔沃基疗法和被动免疫疗法等也存在争议[5]。因此,有效的狂犬病治疗方案和抗狂犬病药物筛选成为狂犬病防治工作的重心。

加利地韦(Galidesivir,BCX4430)是一种腺苷类似物,可以直接破坏病毒RNA依赖的RNA聚合酶(RdRp)进而表现出抗病毒活性。作为一种直接作用的抗病毒活性分子,BCX4430主要用于治疗高致病性病毒引起的感染[6]。研究表明,BCX4430在埃博拉病毒(Ebla virus,EBOV)感染过程中呈现出较好的抗病毒活性[7],对新型冠状病毒感染具有一定的抗病毒效果,在抗新型冠状病毒治疗中具有较高的潜力[8]。本实验主要研究BCX4430对不同狂犬病病毒感染的体外抑制作用,从而为狂犬病的治疗提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材 料

1.1.1 细胞和病毒 实验所需的仓鼠肾细胞BHK-21和小鼠神经瘤母细胞N2a均由本实验室保存; 实验所用的毒株CVS-11是经典的RABV毒株,是CVS毒株经由细胞驯化培养后的固定毒株,由本实验室保存;实验所用的RABV街毒株SC16是在四川病死犬脑内分离而后经由鼠脑传代和细胞适应后的毒株,由本实验室保存。

1.1.2 主要试剂和仪器 BCX4430批号为HY-104077,购自MCE公司,-80 ℃保存备用。DMEM 细胞培养液、胎牛血清(FBS)、双抗和胰酶均购自GIBCO公司,4 ℃保存备用;RABV的N蛋白荧光抗体购自日本Fujirebio公司,-20 ℃保存备用;GoTaq probe-1-StepRT-qPCR试剂盒购自promega公司,-20 ℃保存备用;细胞增殖检测试剂盒(Counting Kit,CCK8)购自东仁化学科技有限公司,-20 ℃保存备用。实验所用的仪器为日本奥林巴斯CXX4I型倒置光学显微镜、日本奥林巴斯IX51 型荧光显微镜、ABI QuantStudio 5荧光定量PCR仪、FLUOstar Omega 415-2683酶标仪和细胞计数仪。

1.2 方 法

1.2.1 药物对细胞活力的毒性测定 N2a及BHK-21细胞贴壁后,分别加入终浓度为0 μmol/L(DMSO对照组)、50 μmol/L、100 μmol/L、150 μmol/L、200 μmol/L、250 μmol/L、500 μmol/L的BCX4430处理24 h、48 h和72 h,设置3次重复实验组,处理结束后加入10%总体积的CCK-8试剂,在培养箱中孵育1 h,用酶标仪测定其在450 nm波长处的OD值,应用计算公式得出各实验组的细胞存活率,进而分析不同浓度药物及处理时间对细胞活力的影响。计算公式为:[(实验孔-空白孔)/(对照孔-空白孔)]×100%。

1.2.2 病毒滴度测定 准备检测板和稀释板,在稀释板的两行中加入200 μL DMEM,然后分别在第一孔加入50 μL病毒原液,而后进行5倍梯度稀释,每次混匀7～10次,混匀后从稀释板各转100 μL至检测板相应孔内,将N2a细胞和BHK-21细胞消化后每孔加入100 μL 细胞悬液,培养箱中培养48 h,然后弃细胞上清液,用80%冷丙酮固定感染细胞,最后采用直接免疫荧光法并通过荧光显微镜观察记录荧光灶,根据Reed-Muench方法计算病毒滴度[9-10]。

1.2.3 实时荧光定量PCR对RABV 滴度的测定 CVS-11和SC16感染N2a细胞和BHK-21细胞后,加入不同浓度BCX4430处理72 h,收集细胞样本并提取RNA,测定RNA 浓度,而后参照GoTaq探针一步法试剂盒说明书,加入特异性探针和引物等反应体系,按照相应的反应条件利用实时荧光定量PCR法检测各试验组中RABV的mRNA 水平。

1.2.4 BCX4430对狂犬病病毒复制的抑制作用 将N2a细胞和BHK-21细胞按照一定比例接种于12孔细胞培养板,待细胞贴壁后加入CVS-11和SC16,感染1 h后分别加入终浓度为0 μmol/L(DMSO对照组)、50 μmol/L、100 μmol/L、150 μmol/L、200 μmol/L、250 μmol/L、500 μmol/L 的BCX4430处理细胞24 h、48 h和72 h,采用直接免疫荧光法进行荧光灶读数,对病毒滴度进行测定,每组设立3次重复实验。

1.2.5 数据分析 使用SPSS 17.0和GraphPad Prism 9.0软件对实验所得数据进行分析,组间比较采用多样本方差分析,组间两两比较采用SNK法,P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 BCX4430对N2a及BHK-21细胞的毒性作用 CCK-8细胞毒性实验结果(图1)表明,浓度为500 μmol/L以内的BCX4430处理N2a及BHK-21细胞24 h、48 h、72 h,细胞均未见明显的细胞毒性作用,故本实验选择的安全作用浓度为500 μmol/L以内。

图1 不同浓度BCX4430对BHK-21细胞和N2a细胞存活率的影响

2.2 病毒的滴度测定 根据计算公式可得,在BHK-21细胞系感染中CVS-11滴度为105.21FFU/mL,SC16的滴度为105.06FFU/mL;在N2a细胞系感染中CVS-11滴度为105.86FFU/mL,SC16的滴度为105.43FFU/mL,本实验确立CVS-11及SC16感染两种细胞系的感染复数(multiplicity of infection,MOI)为1。

2.3 BCX4430在RABV感染不同阶段抑制病毒复制 为了确定BCX4430对RABV感染不同阶段对病毒的抑制效果,用CVS-11病毒感染N2a细胞,预加药4 h、2 h、1 h、0 h分别加入250 μmol/L的BCX4430(图2A),结果表明与对照组相比,预加药4 h、2 h、1 h加入BCX4430对病毒的抑制效果不明显,抑制作用差异无统计学意义(F4-0 h=0.952,F2-0 h=0.521,F1-0 h=0.325,均P>0.05),而在病毒感染后加入BCX4430可以明显抑制病毒的复制(F0-24 h=267.47,P<0.01)(图2B),病毒感染各阶段的mRNA的相对表达水平检测结果也表现出类似的趋势(F4-0 h=6.725,F2-0 h=3.46,F1-0 h=4.32,均P>0.05;F0-24 h=283.59,P<0.01)(图2C)。

A:CVS-11感染N2a细胞不同阶段加入BCX4430示意图;B:各处理阶段病毒滴度;C:各处理阶段mRNA相对表达水平(* P<0.05,** P<0.01)。

2.4 BCX4430体外抑制狂犬病病毒的复制 CVS-11和SC16毒株感染BHK-21细胞,加入不同浓度(50 μmol/L、100 μmol/L、150 μmol/L、200 μmol/L、250 μmol/L、500 μmol/L)BCX4430处理24 h、48 h和72 h后,结果显示与对照组相比,不同浓度的BCX4430均可有效抑制狂犬病病毒在BHK-21细胞上的复制,250 μmol/L和500 μmol/L的抑制效果最明显且抑制率达90%以上(F250 μmol/L=253.61,F500 μmol/L=271.09,均P<0.01)(图3)。CVS-11和SC16毒株感染N2a细胞后,BCX4430对病毒的抑制效果和BHK-21细胞趋于一致,250 μmol/L和500 μmol/L的抑制效果最明显且抑制率均达到90%以上(F250 μmol/L=261.63,F500 μmol/L=273.21,均P<0.01)(图4)。结果表明BCX4430可以有效抑制RABV的复制水平且呈现一定的剂量依赖性,250 μmol/L和500 μmol/L的BCX4430抑制效果最明显,且在病毒感染48 h后抑制效果最佳(F250 μmol/L=234.85,F500 μmol/L=254.68,均P<0.01),病毒感染72 h,BCX4430仍可以有效抑制RABV的复制(F250 μmol/L=247.17,F500 μmol/L=282.89,均P<0.01)。250 μmol/L和500 μmol/L BCX4430均无明显的细胞毒性,因此后期实验确定BCX4430最适浓度为250 μmol/L,最适处理时间为48 h。

A:CVS-11感染BHK-21细胞不同浓度BCX4430处理24 h病毒滴度;B:CVS-11感染BHK-21细胞不同浓度BCX4430处理48 h病毒滴度;C:CVS-11感染BHK-21细胞不同浓度BCX4430处理72 h病毒滴度;D:SC16感染BHK-21细胞不同浓度BCX4430处理24 h病毒滴度;E:SC16感染BHK-21细胞不同浓度BCX4430处理48 h病毒滴度;F:SC16感染BHK-21细胞不同浓度BCX4430处理72 h病毒滴度。(* P<0.05,** P<0.01)

A:CVS-11感染N2a细胞不同浓度BCX4430处理24 h病毒滴度;B:CVS-11感染N2a细胞不同浓度BCX4430处理48 h病毒滴度;C:CVS-11感染N2a细胞不同浓度BCX4430处理72 h病毒滴度;D:SC16感染N2a细胞不同浓度BCX4430处理24 h病毒滴度;E:SC16感染N2a细胞不同浓度BCX4430处理48 h病毒滴度;F:SC16感染N2a细胞不同浓度BCX4430处理72 h病毒滴度。(* P<0.05,** P<0.01)

2.5 BCX4430抑制狂犬病病毒mRNA的表达 以MOI=1的CVS-11和SC16分别吸附BHK-21细胞和N2a细胞,分别加入终浓度为250 μmol/L的BCX4430、50 μmol/L的利巴韦林和1 000 μmol/L的T-705处理细胞48 h后,结果表明BCX4430对CVS-11的抑制率和利巴韦林相当,差异无统计学意义(FN2a=0.53,FBHK-21=0.62,均P>0.05),优于T-705(FN2a=287.06,FBHK-21=262.83,均P<0.01),BCX4430对SC16的抑制效果与CVS-11趋于一致(图5、图6)。同时,对各处理组狂犬病病毒mRNA的相对表达水平进行检测,结果表明BCX4430可以有效降低狂犬病病毒mRNA的表达,与利巴韦林的抑制效果类似,差异无统计学意义(FN2a=0.39,FBHK-21=0.44,均P>0.05),均优于T-705(FN2a=263.72,FBHK-21=252.38,均P<0.01)(图5和图6),与前期实验结果一致[12]。

A:CVS-11感染BHK-21细胞BCX4430、T-705和利巴韦林处理48 h 结果;B:SC16感染BHK-21细胞BCX4430、T-705和利巴韦林处理48 h 结果;C:CVS-11感染BHK-21细胞BCX4430、T-705和利巴韦林处理48 h 病毒滴度;D:SC16感染BHK-21细胞BCX4430、T-705和利巴韦林处理48 h病毒滴度;E:CVS-11感染BHK-21细胞BCX4430、T-705和利巴韦林处理48 h 病毒mRNA相对表达水平;F:SC16感染BHK-21细胞BCX4430、T-705和利巴韦林处理48 h 病毒mRNA相对表达水平。(* P<0.05,** P<0.01)

A:CVS-11感染N2a细胞BCX4430、T-705和利巴韦林处理48 h 结果;B:SC16感染N2a细胞BCX4430、T-705和利巴韦林处理48 h 结果;C:CVS-11感染N2a细胞BCX4430、T-705和利巴韦林处理48 h 病毒滴度;D:SC16感染N2a细胞BCX4430、T-705和利巴韦林处理48 h 病毒滴度;E:CVS-11感染N2a细胞BCX4430、T-705和利巴韦林处理48 h 病毒mRNA相对表达水平;F:SC16感染N2a细胞BCX4430、T-705和利巴韦林处理48 h 病毒mRNA相对表达水平。(* P<0.05,** P<0.01)

3 讨 论

狂犬病在全球仍然广泛存在,作为可防不可治的动物源性传染病,其致死率高达100%,严重威胁人类健康,给全球经济造成负担。截至目前,仍然缺乏特异性药物和有效方案治疗狂犬病,但抗病毒药物筛选已经成为狂犬病防治工作的重要组成部分。研究报道,利巴韦林、T-705、干扰素 α、异丙肌苷(Isoprinosine,IPS)金刚烷胺、五没食子酰葡萄糖(1,2,3,4,6-penta-O-galloyl-β-D-glucose,PGG)和雷帕霉素酶(TMR-001)等药物表现出良好的体外抗狂犬病病毒作用[4,13-15],但在使用条件和使用方案等方面均存在一定的局限性。此外也有研究表明,瑞德西韦在一定程度上可以阻断RABV吸附从而抑制病毒的复制[16],霉菌毒素T-2对RABV吸附具有一定的干扰作用进而降低病毒的复制水平[17],脱氧雪腐镰刀菌烯醇(Deoxynivalenol,DON)对RABV的吸附和进入均具有抑制作用,对RABV的抑制效果存在一定的剂量依赖性[18]。

BCX4430是一种新型的腺苷类似物,被设计用于抑制靶向病毒RdRp活性。研究报道,在各种实验性感染的情况下,肌肉注射、腹膜注射或口服给药后BCX4430均表现出良好的耐受性。同时,在疗效研究过程中,BCX4430也表现出良好的抗病毒作用,并且没有出现任何的全身毒性或局部不良反应[19]。此外,也有研究表明BCX4430在抑制多种RNA病毒(MERS-CoV、EBOV、MARV、SARS-CoV、ZIKV和YFV)感染过程中表现出广谱作用[20-21]。本实验初步研究了BCX4430对BHK-21和N2a细胞的毒性作用,结果表明BCX4430浓度在500 μmol/L内对两种细胞系无明显的细胞毒性。同时,病毒感染前不同阶段和病毒感染后分别加入BCX4430处理,结果表明预加药对病毒的抑制作用不显著,病毒感染后加入BCX4430可以有效抑制病毒的复制。CVS-11和SC16毒株感染BHK-21和N2a细胞后,加入不同浓度的BCX4430分别处理24 h、48 h和72 h,结果发现BCX4430可以有效抑制RABV的复制水平且呈现一定的剂量依赖性,250 μmol/L的BCX4430抑制效果最佳,病毒感染48 h的抑制作用最明显,且在病毒感染后期也表现出较好的抑制效果。此外,基于利巴韦林和T-705对RABV抑制效果的研究[22-24],本实验将利巴韦林、T-705和BCX4430对RABV的抑制效果进行比较,结果发现BCX4430表现出与利巴韦林相似的抗RABV作用,对RABV的抑制效果强于T-705。

抗狂犬病药物筛选已然成为狂犬病防治的重心,本实验结果表明,体外条件下BCX4430可以有效抑制RABV的复制,且细胞毒性较小,安全性较高,可以作为治疗狂犬病的潜在药物,为抗狂犬病药物的进一步研发提供参考。

利益冲突：无