西藏亚东县蜱虫分子生物学鉴定及蜱媒病原体的调查研究

林玉莲,张维璐,多吉欧珠,贺 真,陆振华,次仁潘多,赵 哲,李 丽,龙 泳

亚东县位于西藏自治区南部,与印度和不丹相邻,南北落差达5 000多米,自然生态环境优良,畜牧养殖为当地重要的经济产业。亚东县年平均气温仅1.1 ℃,牲畜是蜱虫的最佳供暖供血者。蜱虫可以携带并传播多种病原体,严重影响着牧民和牲畜的健康。蜱虫的形态学鉴定由于蜱虫种类繁多、结构相似和同种个体遗传变异性等多种原因,仅在属的分类上更具有准确的判断,而细胞色素C氧化酶亚基I(COX I)、线粒体16S rDNA和12S rDNA基因已经能在种水平上对蜱类进行鉴定[1-2]。莱姆病、Q热、斑点热、土拉是西藏自治区人群感染媒介疾病调查的重点,在畜牧养殖发达的个别地区人和牲畜处于高感染率情况[3]。本研究通过分子生物学技术鉴定2021年亚东县采集蜱虫的种类,筛查蜱虫可能携带的病原体,研究它们的分子发育系统,并进一步通过血清学研究亚东县居住人群莱姆病、Q热、斑点热、土拉的感染情况,为当地制定蜱媒疾病防控措施提供依据。

1 材料与方法

1.1 核酸提取 取经过形态学鉴定分类后的蜱虫,3～5只分组,每组先经生理盐水冲洗3次,再用上海净信公司生产的组织破碎仪(Tissnelyser-48L)进行研磨;采用天隆科技有限公司提供的核酸提取试剂盒,磁珠法提取研磨液中的蜱虫核酸。

1.2 PCR扩增与测序 应用oligo7对文献中查找的蜱虫鉴定引物和斑点热群立克次体、伯氏疏螺旋体、土拉热弗朗西氏菌、贝氏柯克斯体扩增引物进行综合评价,选择蜱虫细胞色素C氧化酶亚基I(COX I)、线粒体16S rDNA、12S rDNA基因的3对引物由北京擎科生物科技有限公司合成,其余引物由北京奥科生物技术有限责任公司合成。以提取的全蜱基因组DNA为模板,Thermo Fisher Scientific公司提供DreamTaq PCR Master Mix (2X)和Water,nuclease-free,PCR扩增目的基因。COX I、16S rDNA、12S rDNA扩增条件分别为:95 ℃ 3 min;95 ℃ 30 s,45 ℃/50 ℃/50 ℃ 30 s,72 ℃ 1 min,35个循环;72 ℃ 10 min。斑点热群立克次体、伯氏疏螺旋体、土拉热弗朗西氏菌、贝氏柯克斯体扩增条件分别为:95 ℃ 3 min;95 ℃ 30 s,第1轮50 ℃,第2轮52 ℃/第1轮50 ℃,第2轮52 ℃/第1轮60 ℃,第2轮60 ℃/55℃ 30 s,72 ℃ 1 min,35个循环;72 ℃10 min。琼脂糖凝胶电泳阳性样本的PCR产物由北京擎科生物科技有限公司测序,表1。

1.3 基因序列的同源性及遗传进化分析 利用DNA Star软件对测得序列进行拼接和矫正,与GenBank中查询的相似序列进行同源性分析,利用MEGA 7.0软件基于ClustalW程序对获得的基因序列与GenBank中前一百条相似的不同种类序列和常见种类代表序列进行比对,采用MEGA 7.0默认参数,进行邻近法(Neighbor-joining method,NJ),Bootstrap values设置为1 000,构建系统进化树。

1.4 人血清莱姆病、Q热、斑点热、土拉抗体ELISA检测 采用间接法酶联免疫吸附试验(ELISA),具体实验依据试剂盒说明书,对2021年亚东县居住人群的184份血清分别进行莱姆病、Q热、斑点热、土拉lgG抗体筛查。ELISA试剂盒购自上海科顺生物科技有限公司和上海科博瑞生物科技有限公司。读取全自动酶标仪(科华ST-360)450 nm波长下吸光度(OD值),判断标本中是否存在病原体抗体。应用EXCEL、SPSS 25.0统计软件分析数据,计数资料组间比较采用χ2检验,P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 蜱虫COX I、16S rDNA、12S rDNA基因序列的同源性与遗传进化分析 西藏亚东县采集的硬蜱分属两类,其中一类硬蜱COX I、16S rDNA、12S rDNA基因序列与GenBank中拟蓖硬蜱Ixodesnuttallianus核苷酸相似性分别为99.5%、97.57%、99.12%;另一类硬蜱COX I、16S rDNA基因序列与GenBank中卵形硬蜱Ixodesovatus核苷酸相似性分别为88.29%、95.75%,其中16S rDNA基因序列与GenBank中Ixodessp.KH-2019(登录号为LC498630.1)核苷酸相似性达99.26%,该序列来源自不丹国家。血蜱COX I、16S rDNA、12S rDNA基因序列与GenBank已知西藏血蜱Haemaphysalistibetensis核苷酸相似性分别为96.04%、96.17%、97.47%,与尼泊尔血蜱Haemaphysalisnepalensis核苷酸相似性分别为95.92%、97.13%、96.66%。

蜱虫COX I 基因序列的系统发育树分为血蜱和硬蜱两大进化主支,血蜱和硬蜱各自成簇,本研究测得的COX I序列(样本标号YD2021-T1)与源自西藏自治区日喀则市的拟蓖硬蜱Ixodesnuttallianus(登录号为NC_062062.1)序列遗传距离较近,同源性较高;COX I序列(样本标号YD2021-T2)与卵形硬蜱Ixodesovatus(登录号为OM317739.1、OP244858.1)聚类为一支。尼泊尔血蜱Haemaphysalisnepalensis(登录号为NC_064124.1)与西藏血蜱Haemaphysalistibetensis(登录号为OM049539.1、OM368296.1)先聚类为一支,再与本研究测得COX I序列(样本标号YD2021-T3)聚类为一支,图1。

注:“△”表示本研究从2021年西藏亚东县收集的23只蜱虫中扩增得到的COX I 基因。

蜱虫16S rDNA基因序列系统发育树的两大进化主支均包含了血蜱和硬蜱,但是在分支上各自的聚类成簇,说明血蜱属和硬蜱属在分子水平上具有一定的生物多样性。研究测得16S rDNA序列(样本标号YD2021-T2)与源自不丹的Ixodes sp.KH-2019(登录号为LC498630.1)序列进化距离较近,同源性较高,图2。

蜱虫12S rDNA基因序列系统发育树分为三大进化主支,本研究测得的2个12S rDNA序列(样本标号YD2021-T1、YD2021-T3)先聚类为一支,再与血蜱和硬蜱聚类成发育树主干,研究测得的序列与下载的相似序列遗传距离较远,图3。

注:“△”表示本研究从2021年西藏亚东县收集的23只蜱虫中扩增得到的12S rDNA 基因。

2.2 4种蜱媒病原体扩增情况及斑点热群立克次体gltA基因序列的同源性和遗传进化分析 2021年西藏亚东县收集的23只蜱虫,伯氏疏螺旋体、土拉热弗朗西氏菌、贝氏柯克斯体序列PCR扩增后,电泳条带均呈阴性结果;斑点热群立克次体gltA基因扩增后,电泳阳性条带与gltA基因目的片段长度大致相同在381 bp位置。经测序获得的序列与GenBank已知CandidatusRickettsiatarasevichiae核苷酸相似性96.77%,与Rickettsiaraoultii核苷酸相似性96.76%,与Rickettsiacanadensis核苷酸相似性95.35%,与Rickettsiaendosymbiont of Eucoryphus brunneri核苷酸相似性95.35%。系统发育树可分为4个进化主支,其中CandidatusRickettsiatarasevichiae(登录号为KP207593.1)与Rickettsiaraoultii(登录号为KM279355.1)先聚类为一支后,再与研究测得序列(YD2021)聚类为一支,然后再与Rickettsiacanadensis(登录号为AB297809.1)、Rickettsiaendosymbiont of Eucoryphus brunneri(登录号为JQ925624.1)聚类,遗传距离较近,说明它们都有较高的同源性,图4。

注:“△”表示本研究从2021年西藏亚东县收集的23只蜱虫中扩增得到的斑点热群立克次体gltA基因。

2.3 亚东县居住人群184份血清莱姆病、Q热、斑点热、土拉的感染情况 亚东县居住人群184份血清莱姆病、Q热、斑点热、土拉抗体阳性率分别为6.52%、12.50%、8.70%、10.87%。莱姆病抗体男性阳性率4.04%,女性阳性率9.41%,阳性男女性别比为0.50∶1,女性阳性率大于男性,男性和女性阳性率比较差异无统计学意义(χ2=2.164,P>0.05);莱姆病抗体藏族阳性率4.50%,汉族阳性率8.96%,阳性藏族和汉族比为0.83∶1,汉族阳性率大于藏族,藏族和汉族阳性率比较差异无统计学意义(χ2=0.763,P>0.05),表2。

表2 2021年亚东县人血清四种蜱媒疾病抗体检测情况

Q热抗体男性阳性率8.08%,女性阳性率17.65%,阳性男女性别比为0.53∶1,女性阳性率大于男性,男性和女性阳性率比较差异无统计学意义(χ2=3.827,P>0.05);Q热抗体藏族阳性率12.61%,汉族阳性率11.94%,阳性藏族和汉族比为1.75∶1,藏族阳性率大于汉族,藏族和汉族阳性率比较差异无统计学意义(χ2=0.017,P>0.05),表2。

斑点热抗体男性阳性率13.13%,女性阳性率3.53%,阳性男女性别比为4.33∶1,男性阳性率大于女性,男性和女性阳性率比较差异有统计学意义(χ2=5.311,P<0.05);斑点热抗体藏族阳性率6.31%,汉族阳性率13.43%,阳性藏族和汉族比为0.78∶1,汉族阳性率大于藏族,藏族和汉族阳性率比较差异无统计学意义(χ2=2.594,P>0.05),表2。

土拉抗体男性阳性率16.16%,女性阳性率4.71%,阳性男女性别比为4.00∶1,男性阳性率大于女性,男性和女性阳性率比较差异有统计学意义(χ2=6.195,P<0.05);土拉抗体藏族阳性率7.21%,汉族阳性率17.91%,阳性藏族和汉族比为0.67∶1,汉族阳性率大于藏族,藏族和汉族阳性率比较差异有统计学意义(χ2=4.799,P<0.05),表2。

将亚东县居住人群共分为7个年龄组,统计各年龄组感染阳性率,4种蜱媒疾病抗体高阳性率分布在20～60岁年龄段,为主要感染人群,1～10岁年龄段的人群感染阳性率较高,而11～20岁和≥61岁年龄段的人群感染阳性率较低,4种蜱媒疾病检测人群的各年龄段感染阳性率差异无统计学意义,见表2。

3 讨 论

2021年西藏亚东县采集的23只蜱虫在形态学初步鉴定下,大致分为硬蜱属和血蜱属两类。本研究基于蜱标准DNA条形码系统,细胞色素C氧化酶亚基I(COX I)、线粒体16S rDNA和12S rDNA基因,利用DNA标记技术进行了种的分类鉴定。考虑到单个DNA条形码在蜱种鉴定上可能存在的问题,比如我们在大量的蜱类鉴定实验过程中发现,从蜱标本中提取12S rDNA基因的效率不高,COX I、16S rDNA、12S rDNA基因都可能针对某些类群蜱种鉴定不具优势[1]。本研究选取了3个DNA条形码引物对同一样本进行扩增,COX I基因从蜱标本中提取效率最高,引物质量最好,表现在电泳目标条带宽大明亮而无杂带,而12S rDNA基因常常因为提取困难而扩增失败,所以需要综合分析让蜱虫分类结果更准确。

经过综合分析,2021年亚东县收集的蜱虫可分为3类,拟蓖硬蜱Ixodesnuttallianus、卵形硬蜱Ixodesovatus和西藏血蜱Haemaphysalistibetensis,血蜱不排除为尼泊尔血蜱Haemaphysalisnepalensis的可能,因为西藏血蜱和尼泊尔血蜱具有较高的同源性。另外,本研究测得的亚东县蜱虫16S rDNA序列(样本标号YD2021-T2)与源自不丹的Ixodessp.KH-2019(登录号为LC498630.1)序列核苷酸相似性达99.26%,遗传距离也很接近,可认为它们具有高度同源性。不丹与亚东县相邻,蜱类可随着气候环境的融合和动物的迁徙而实现基因交流。查阅既往研究发现,拟蓖硬蜱、卵形硬蜱和西藏血蜱在亚东县均有活跃[9],亚东县暂未见尼泊尔血蜱的报道,且西藏血蜱在西藏广泛存在[10]。

本研究基于斑点热群立克次体gltA基因扩增出的序列,与CandidatusRickettsiatarasevichiae、Rickettsiaraoultii、Rickettsiacanadensis和RickettsiaendosymbiontofEucoryphusbrunneri的核苷酸相似性在96.77%、96.76%、95.35%、95.35%,在遗传距离上也较接近,同源性较高,很难判断扩增所得序列的具体种类。Rickettsiaendosymbiont ofEucoryphusbrunneri是一种立克次体属细菌共生体,细菌共生体虽然在公共卫生意义上尚不清楚,但是在蜱类中非常普遍,许多可归属于人类病原体类,包括斑点热群[11]。本研究PCR试验基于gltA基因可能过于保守,无法区分近源种,可结合基因组测序数据进行分析。

为进一步了解亚东县四种媒介病原体的流行情况,本研究对亚东县居住人群184份血清进行了莱姆病、Q热、斑点热、土拉抗体筛查,结果显示感染率分别为6.52%、12.50%、8.70%、10.87%。张启恩[12]1995年发表的结果显示,莱姆病阳性率为5.19%(30/578),Q热阳性率为10.94%(7/64);张雪莲等[9]2009年调查结果,莱姆病阳性率为4.00%(4/100),Q热阳性率为12.00%(12/100)。研究结果对比,亚东县莱姆病和Q热人群感染阳性率均有上升。由于3项调查在时间上相隔较长,很多原因都可能导致人群感染阳性率的改变,比如全球气候变暖、人口流动、土地利用变化、城市化和国际贸易等驱动因素都可能促进蜱媒疾病的传播流行[13]。

亚东县人群检测的4种蜱媒疾病中,斑点热和土拉抗体阳性率在性别上,男性均大于女性,土拉抗体阳性率在民族上,汉族大于藏族差异有统计学意义。有研究表明,人群对4种疾病普遍易感,无种族、年龄和性别上的差异,但是感染率的高低与接触感染源、接触途径和时间长短有关[14-15]。本次研究在性别上阳性率差异的原因,可能是亚东县居住人群中男性的林、牧作业量要大于女性,男性的蜱暴露几率大于女性且保护意识较低,机会感染率更高。亚东县20～60岁年龄段人群为莱姆病、Q热、斑点热、土拉的主要感染人群,同时是畜牧养殖的主要作业人群,受教育程度相对较低,保护意识薄弱,蜱暴露高风险人群,有必要做好个人防护;1～10岁年龄段的人群感染阳性率较高,提示要关注低年龄段感染媒介疾病的风险,建立好免疫屏障[16]。

利益冲突：无