HPLC法测定葫芦七不同部位中7种倍半萜的含量

李俊 崔蕾 李晓杰 曹爱兰 张丽军 杜文娟

摘要  ［目的］建立HPLC法测定葫芦七不同部位（根、茎、叶）中7种倍半萜类化合物的含量。［方法］采用Kromasil C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）色谱柱，流动相为乙腈-水（40∶60）；柱温35 ℃；检测波长240 nm；进样体积10 μL。［结果］7种被测成分在测定质量浓度范围内线性关系良好（R2≥0.999 0）；平均回收率在95.18%～97.61%，RSD在0.41%～1.60%；被檢测的7种倍半萜类成分在葫芦七根、茎、叶不同部位中的含量差异明显，根中所含化合物的种类相对较多，含量相对较高。［结论］该方法快速、简便、准确，可用于葫芦七药材的质量控制。

关键词  葫芦七；HPLC法；不同部位；倍半萜；含量测定

中图分类号  R284  文献标识码  A  文章编号  0517-6611（2024）01-0187-05

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2024.01.041

开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Determination of Seven Sesquiterpenes in Different Parts of Ligularia fischeri by HPLC Method

LI Jun1，2，3， CUI Lei1，2，3， LI Xiao-jie2，3，4 et al

（1.Traditional Chinese Medicine Research Department，Shaanxi Chinese Medicine Institute （Shaanxi Pharmaceutical Information Centre），Xianyang，Shaanxi 712000;2.Shaanxi Province “Four Subjects and One Combination” Traditional Chinese Medicine Extraction and Separation and Preparation Process Engineering Technology Research Center， Xi’an， Shaanxi 710075;3.Key Laboratory of Traditional Chinese Medicine and Natural Medicine Research and Development in Shaanxi Province， Xi’an， Shaanxi 710075;4. Shaanxi Pharmaceutical Holding Pharmaceutical Research Institute Co.， Ltd.， Xi’an， Shaanxi 710075）

Abstract  ［Objective］To establish a HPLC method determinate seven sesquiterpenes in different parts of Ligularia fischeri. ［Method］Chromatographic column was Kromasil C18 （4.6 mm）×250 mm， 5 μm）， mobile phase was acetonitrile water （40∶60）;column temperature was 35 ℃;detection wavelength was 240 nm;injection volume was 10 μL.［Result］The linearity of seven sesquiterpenes was good in the range of their mass concentration （R2≥0.999 0）;the average recovery rates were 95.18%-97.61%， RSDs were 0.41%-1.60%.The content of seven sesquiterpenoids detected in different parts of the root， stem and leaf of Ligularia fischeri were significantly different. The content and kinds of compounds in roots were higher than that in other parts. ［Conclusion］The method was fast， simple and accurate，and can be used for the quality control of Ligularia fischeri.

Key words  Ligularia fischeri;HPLC method;Different parts;Sesquiterpene;Content determination

基金项目  陕西省科技厅重点研发计划项目（2022SF-300） 。

作者简介  李俊（1990—），女，湖北十堰人，主管药师，硕士，从事中药新药及中药物质基础研究。

收稿日期  2023-02-08；修回日期  2023-03-09

秦岭太白山药用植物种类繁多，起源古老，素有“药山”和“宝山”之称，是天然中草药种质基因库，被称为“中国天然植物园”，素有“秦地无闲草”的美誉。目前查明的药用植物就有800多种，大多数为草本双子叶植物，其中的草药习惯上以“七”字命名，较为著名的就属“太白七药”［1］。太白七药因其独特的疗效在民间享有一定信誉，在陕西大部分地区广为流传，主治多种疾病，疗效显著，具有重要的研究价值［2］，千百年来为陕西地区的农村和山区的医疗保健事业发挥着不可低估的作用。

葫芦七作为太白七药的一种，是菊科橐吾属植物肾叶橐吾［Ligularia fischeri（Ledeb）Turcz.］的干燥根及根茎，又名蹄叶橐吾（中药志）、马蹄叶（东北）、葫芦七（陕西）、马蹄当归（贵州）等，具有散寒润肺、温肺下气、镇咳祛痰、理气活血等功能，用于治疗慢性支气管炎、风寒咳嗽气喘、百日咳、肺痈、咯血、咽喉炎症等，在民间有广泛的应用［2］。现代药理学研究表明，肾叶橐吾具有抗氧化、抗炎、增强免疫力、抗菌、抗溃疡等药理作用。研究发现从不同产地的肾叶橐吾中分离得到的化合物主要是艾里莫酚烷型及桉叶烷型倍半萜，除此之外还有一些二萜、三萜、黄酮、甾体、酚类、生物碱类等化合物［3-11］。艾里莫酚型倍半萜是肾叶橐吾报道最多的一类成分，其结构型大致可分为呋喃型、艾里莫酚烷型、艾里莫酚内酯型3类［9-17］。除了化学成分的研究，近年来对肾叶橐吾的研究还包括微量元素、药理作用等方面，对其质量控制的研究报道比较少。因此，为了进一步研究应用和开发陕西这一特色药用植物，有必要对其中的倍半萜类成分进行分析和含量测定。前期在对葫芦七进行化学成分研究中，从葫芦七中提取分离得到了7种倍半萜类化合物，该研究建立了 HPLC 法测定葫芦七中这7种倍半萜类化合物的含量，并比较了不同部位（根、茎、叶）中这7种倍半萜类化合物的含量差别，以期进一步明确肾叶橐吾的药用部位，并为其资源的开发利用与药材质量控制提供科学依据。

1  材料与方法

1.1  试验材料

1.1.1  仪器。

Shimadzu LC 2010AHT型高效液相色谱系统（日本岛津公司）；KH-250E型超声波清洗器（昆山禾利超声仪器有限公司）； EYELAN-1100旋转蒸发仪（上海爱朗仪器有限公司）；AE240电子分析天平（中国梅特勒-托利多仪器厂）；UV-1800紫外分光光度计（日本岛津公司）。

1.1.2  试剂。

乙腈（色谱纯，天津市科密欧化学试剂有限公司）；甲醇（分析纯，成都市科隆化学品有限公司）；水为娃哈哈纯净水。

试验所用的7个标准品7α-H-11-羟基-艾里莫芬-1（10）-烯-2-酮（化合物1）、8β，10β-二羟基艾里莫芬-7（11）-烯-12，8α-内酯（化合物2）、10β-羟基艾里莫芬-7（11）-烯-12，8α-内酯（化合物3）、6β-羟基艾里莫芬-7（11）-烯-12，8β-内酯（化合物4）、6α-羟基艾里莫芬-7（11）-烯-12，8α-內酯（化合物5）、8α-羟基艾里莫芬-1（10），7（11）-二烯-12，8β-内酯（化合物6）、 8β-羟基艾里莫芬-7（11）-烯-12，8α-内酯（化合物7）均为从葫芦七中分离得到，并经波谱技术鉴定，HPLC峰面积归一法测定，纯度均大于98%，化合物结构式见图1。

1.1.3  试材。

研究所用葫芦七药材采自陕西省西安市鄠邑区，植物标本由西安交通大学医学部药学院刘霞教授鉴定为菊科肾叶橐吾［Ligularia fischeri（Ledeb）Turcz.］。

1.2  试验方法

1.2.1  色谱条件。

色谱柱为Kromasil C18（5 μm，4.6 mm×250 mm）；流动相为乙腈（A）-水（B）=40∶60，等度洗脱，流速 1.0 mL/min，检测波长240 nm，柱温  35 ℃，进样量为10 μL。

1.2.2  对照品贮备液的制备。

分别精密称取化合物1、2、3、4、5、6、7各6.0、9.1、6.0、8.0、5.2、1.3、5.2 mg于5 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，摇匀，配制浓度分别为1.20、1.82、1.20、1.60、1.04、0.26、1.04 mg/mL的对照品贮备液。各对照品贮备液置于4 ℃冰箱冷藏保存。

1.2.3

对照品溶液的制备。分别精密量取各单一对照品储备液500 μL，置5 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，摇匀。分别精密量取2 000、500、200、100、40、20、10、4 μL置于2 mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，得8个不同浓度的对照品溶液。

1.2.4  标准曲线的绘制。7个倍半萜对照品分别按“1.2.3”方法配制成不同浓度的对照品溶液。各对照品不同浓度的对照品溶液分别吸取10 μL注入液相色谱仪中，按“1.2.1”色谱条件，依次分析，测得各峰面积。以峰面积积分值为纵坐标、对照品浓度（mg/mL）为横坐标绘制标准曲线，计算线性回归方程。

1.2.5  供试品溶液的制备。

取葫芦七根、茎、叶粗粉各5 g，精密称定，加入甲醇200 mL，超声提取2次，每次1 h（功率300 W，频率45 kHz），滤过，合并2次滤液，减压蒸干，加入甲醇超声使其成混悬液，将其转移至50 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度。摇匀，经0.45 μm微孔滤膜滤过，即得供试品溶液。

2  结果与分析

2.1  对照品与样品的高效液相色谱图

分别精密吸取各单一对照品储备液适量，加甲醇溶液配制成质量浓度分别为0.120 mg/mL（化合物1）、0.182 mg/mL（化合物2）、0.120 mg/mL（化合物3）、0.160 mg/mL（化合物4）、0.104 mg/mL（化合物5）、0.026 mg/mL（化合物6）、0.104 mg/mL（化合物7）的混合对照品溶液，在“1.2.1”色谱条件下，进样混合对照品溶液及“1.2.5”项下葫芦七供试品溶液，色谱图见图2。

2.2  线性关系考察

以对照品浓度为横坐标、峰面积积分值为纵坐标进行线性回归。各对照品的线性回归方程见表1。通过计算确定各目标化合物的检测限（S/N=3）和定量限（S/N=10）。试验结果表明（表1），各化合物在考察浓度范围内线性关系良好（R2≥0.999 0）。

2.3  精密度试验

按“1.2.1”色谱条件，分别对质量浓度为0.012 0 mg/mL（化合物1）、0.018 2 mg/mL（化合物2）、0.012 0 mg/mL（化合物3）、0.016 0 mg/mL（化合物4）、0.010 4 mg/mL（化合物5）、0.002 6 mg/mL（化合物6）、0.010 4 mg/mL（化合物7）的混合对照品溶液连续进样6次，以峰面积计算精密度，RSD分别为0.38%、1.32%、1.08%、1.73%、0.42%、1.01%、1.38%，表明仪器精密度良好。

2.4  稳定性试验

称取葫芦七根粗粉5.0 g，精密称定，按“1.2.5”方法制备供试品溶液，分别于0、2、4、8、12、18 h进样分析，记录各组分色谱峰的峰面积。经计算，7个组分各自色谱峰峰面积的RSD分别为0.68%、0.91%、1.10%、0.78%、0.93%、1.20%、1.30%，表明供试品溶液在室温下18 h内不会发生较大变化。

2.5  重复性试验

称取葫芦七根粗粉5.0 g共6份，精密称定，按“1.2.5”方法制备供试品溶液，依次测定药材中7种倍半萜化合物的含量。结果显示，6份样品测出7个组分色谱峰峰面积的RSD分别为0.55%、0.76%、1.08%、0.89%、1.01%、0.98%、0.85%，表明该方法重复性良好。

2.6  加样回收率

取已知含量的葫芦七根粗粉6份，每份约2.5 g，精密称定，再分别精密加入质量浓度分别为1.20 mg/mL（化合物1）、1.82 mg/mL（化合物2）、1.20 mg/mL（化合物3）、1.60 mg/mL（化合物4）、1.04 mg/mL（化合物5）、0.26 mg/mL（化合物6）、1.04 mg/mL（化合物7）的对照品溶液适量，按照“1.2.5”方法制备供试品溶液，按“1.2.1”色谱条件测定，计算回收率，试验结果见表2。从表2可以看出，平均加样回收率在95.18%～97.61%，RSD在0.41%～1.60%，表明该方法准确度良好。

2.7  樣品测定

分别精密称取葫芦七的根、茎、叶粗粉5.0 g，按照“1.2.5”方法制备供试品溶液，按照“1.2.1”色谱条件，对7个目标化合物进行含量测定，计算各目标化合物的含量，结果见表3。从表3可以看出，只有化合物3和化合物6在葫芦七药材的根、茎、叶中均能检测到，其中化合物3在各个部位的含量从高到低依次为叶、茎、根，化合物6在各个部位的含量从高到低依次为根、茎、叶；其他化合物只在葫芦七的部分部位被检测到，其中化合物1和化合物4仅在根中含有，化合物2、化合物5和化合物7在根、叶中含有；被检测的7种倍半萜类成分在葫芦七根、茎、叶不同部位中的含量差异明显。根中可以检测到7种化合物（化合物1、2、3、4、5、6、7），叶中能检测到5种（化合物2、3、5、6、7）；茎中仅能检测到2种化合物（化合物3、6）。比较各个部位所含化合物发现，根中所含化合物的种类相对较多，含量相对较高。在民间有将肾叶橐吾地下部分根和根茎入药的习惯，有本草依据和相当长的用药历史，可追溯到宋代苏颂著的《图经本草》，该研究更是为这一传统用药习惯提供了试验依据。

3  讨论

3.1  波长选择

对各对照品进行全波长（190～400 nm）扫描，综合考虑和比较各目标化合物在紫外下的最大吸收波长，发现在 240 nm下7个目标化合物均有较强的紫外吸收，所以选择240 nm作为检测波长。

3.2  流动相选择

为了使各目标化合物的色谱峰得到更好的分离，应选择一个合适的流动相体系。该研究考察了甲醇-水和乙腈-水的流动相系统，后者的洗脱效果好于前者，所以采用乙腈-水系统，经过多次试验最终确定乙腈-水为40∶60，峰形良好。

4  结论

目前，葫芦七药材一直未列入陕西省地方标准和国家药典，限制了其进一步开发和应用，致使葫芦七产业的发展较慢，急需建立葫芦七药材的质量控制标准。该研究首次对葫芦七中7 种倍半萜类成分进行定量分析，结果发现不同部位中各成分含量差异较大，同一部位不同化合物间的含量差异也很大；其中根中所含化合物的种类相对较多，含量相对较高，该研究结果为其在民间将根和根茎入药的这一传统用药习惯提供了试验依据。该研究建立的 HPLC 测定方法简便快速、分离度好、结果稳定可靠，可以为葫芦七药材的质量控制提供科学依据。

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