疏肝健脾颗粒对大鼠乳腺癌癌前病变组织Fas、FasL表达的影响

王 莹,张 明,王红月,李湘奇

(1山东第一医科大学第二附属医院·山东 泰安 271000;2泰安市中心医院·山东 泰安 271000)

乳腺癌的发病率逐年攀升,目前已经跃居女性恶性肿瘤的首位[1]。乳腺癌如能早期诊断, 早期治疗,可提高病人的生存获益,并有效改善病人的生存质量。乳腺的癌前病变,是乳腺浸润性癌癌变过程中的一个阶段,是乳腺组织从量变到质变的过程,在转化成乳腺癌之前,经过干预可逆转乳腺癌的进程。复方中药疏肝健脾颗粒是本院科研处方,又名乳康饮,具有疏肝理气、益气健脾、化瘀散结的功效,已广泛应用于乳腺癌的临床辅助治疗[2]。前期研究发现,其含药血清作用于乳腺癌MDA-MB-231细胞,对Hippo信号通路蛋白YAP、TAZ的表达有抑制作用,对YAP、TAZ的磷酸化有促进作用,并阻碍了YAP蛋白在细胞核内的聚集,通过下调其下游与细胞增殖、凋亡相关靶基因的表达,诱导MDA-MB-231细胞凋亡[3];但对乳腺癌癌前病变是否有抑制作用,有待于进一步研究。本研究选用雌孕激素与二甲基苯蒽(DMBA)联合诱发大鼠乳腺组织的癌前病变,同时给予不同剂量的疏肝健脾颗粒进行干预,免疫组化法检测乳腺癌前病变组织Fas、FasL蛋白表达,初步探讨疏肝健脾颗粒对模型大鼠乳腺组织癌前病变的作用。

1 材料

1.1 实验动物 雌性SD大鼠90只,SPF级, 6～8 周龄,健康未育,体质量180～220 g,动物许可证号：SYXK(鲁)2012-0005,购于济南朋悦实验动物繁育有限公司。常规饲养1 周以适应环境。饲养条件：室内温度18～26 ℃,相对湿度42%～70%,通风换气良好。

1.2 实验药物 疏肝健脾颗粒剂由黄芪、茯苓、柴胡、青皮、薏苡仁、莪术组成,由北京康仁堂药业有限公司生产的单味药颗粒混合而成,购自山东第一医科大学第二附属医院中药房,按照处方比例,溶于100 mL生理盐水,然后根据实验要求配成1.8 g/mL生药备用。枸橼酸他莫昔芬片(三苯氧胺)：江苏扬子江药业集团有限公司,国药准字H32021472,实验时按10 mg∶50 mL溶于生理盐水。

1.3 试剂及仪器 Fas/CD95/Apo-1(RAB-0022)兔抗人多克隆抗体、Fas-L(RAB-0199)兔抗人多克隆抗体、S-P免疫组化试剂盒：福州迈新生物技术开发有限公司;链霉卵白素-过氧化物酶试剂盒(SP-9001)、DAB显色浓缩型试剂盒：北京中杉金桥生物技术有限公司;DMBA(9,10-二甲基-1,2苯并蒽)：Sigma公司,产品号：D8480-100,按比例溶于植物油,DMBA终浓度为10 g/L备用;苯甲酸雌二醇：上海通用药业股份有限公司,国药准字H31021114;黄体酮注射液：天津金耀氨基酸有限公司,国药准字H12020533;脱毛膏：广州赛因化妆品有限公司,TP0120648。CM1900型冰冻切片机、EG1150C包埋机：德国LEICA公司; 日本三丰数显500-171游标卡尺;BH-2 OLYMPUS照像显微镜;HPIAS-1000彩色病理图文分析系统：同济医科大学开发;JA5003X型电子精密天平：上海方瑞仪器有限公司。

2 方法

2.1 动物分组、造模、给药 SD大鼠90只按照抽签法随机分为6 组,每组15只,正常对照组：生理盐水一次性灌胃1 mL,第2 天开始,30 d为1个周期(肌肉注射生理盐水0.5 mL/只,连续25 d,观察5 d,共2个周期。其余75只大鼠参照文献[4]方法稍加修改进行造模,将DMBA 10 mg一次性灌胃后,第2天起,5 d为1个周期(第1～3 天,苯甲酸雌二醇0.5 mg/kg后肢肌肉注射,1次/天;第4 天,黄体酮4 mg/kg后肢肌肉注射)连续12个周期;DMBA灌胃24 h后随机分为5组,每组15只。①模型组：造模的同时腹腔注射生理盐水1 mL/100g;②疏肝健脾低剂量组(简称低剂量组)：疏肝健脾颗粒18 g/(kg·d)灌胃;③疏肝健脾中剂量组(简称中剂量组)：疏肝健脾颗粒45 g/(kg·d)灌胃;④疏肝健脾高剂量组(简称高剂量组)： 疏肝健脾颗粒90 g/(kg·d)灌胃;⑤三苯氧胺组：三苯氧胺0.5 mL/100 g灌胃。实验药物灌胃剂量按《抗癌药物研究与实验技术》[5]换算人鼠等效灌胃剂量,以上各组大鼠造模及给药60 d,均常规饲养。

大鼠在DMBA灌胃5 d后,每组均有部分出现程度不等的腹泻、死亡情况,第6周后逐渐趋于平稳,至实验结束时各组剩余动物数量,正常对照组15只、模型组13只、疏肝健脾低剂量组12只、疏肝健脾中剂量组12只、疏肝健脾高剂量组10只、三苯氧胺组11只。

2.2 观察指标及检测方法

2.2.1 癌前病变乳腺组织病理学观察 末次给药后,禁食不禁水12 h,以脱毛剂去除大鼠胸部鼠毛,3%水合氯醛经腹腔注射麻醉,取大鼠胸腹部第3、4对完整乳腺组织,10%福尔马林固定后石蜡包埋,切片厚度4 μm,HE染色,光学显微镜下观察。HE染色根据2012年版WHO乳腺肿瘤组织学分类标准和文献[5-6]分为：正常乳腺、普通乳腺增生、癌前病变、浸润癌。

2.2.2 癌前病变乳腺组织Fas、Fas-L蛋白表达的免疫组化检测 免疫组化S-P法检测,步骤按说明书进行。用迈新公司提供的Fas/Fas-L阳性组织片作为阳性对照,用PBS代替一抗为阴性对照。Fas、FasL阳性强度判断采用半定量法,参照文献标准[7],蛋白阳性染色均为胞浆、胞膜出现棕黄棕褐色均匀颗粒。切片组织中(-)为阳性细胞≤5%,(+)为阳性细胞6%～25%,(++)为阳性细胞达26%～50%,(+++)为阳性细胞>50%。

2.3 统计学方法 采用SPSS 22.0 版统计软件分析,计数资料用χ2检验,P<0.05为有统计学意义。

3 结果

3.1 疏肝健脾颗粒对模型大鼠乳腺组织病理变化的影响 模型组大鼠乳腺癌癌前病变发生率为69.2%,疏肝健脾颗粒各剂量组及三苯氧胺组的癌前病变发生率均低于模型组(P<0.01),疏肝健脾颗粒高剂量组和三苯氧胺组亦低于疏肝健脾颗粒低剂量组(P<0.05),与疏肝健脾颗粒中剂量组差异无统计学意义(P>0.05)。部分大鼠乳腺组织发生浸润癌,主要在模型组和疏肝健脾中、低剂量组,疏肝健脾高剂量组和三苯氧胺组大鼠乳腺组织未见浸润癌发生。结果见表1。

表1 各组大鼠乳腺组织病理变化比较[个(%)]

3.2 疏肝健脾颗粒对模型大鼠乳腺组织Fas、FasL表达的影响 正常对照组大鼠乳腺组织Fas蛋白呈高表达,模型组Fas蛋白表达减弱,疏肝健脾颗粒各剂量和三苯氧胺组Fas表达均较模型组增强(P<0.01),低剂量组作用较弱,与三苯氧胺比较差异有统计学意义(P<0.05)。模型组大鼠乳腺组织FasL蛋白表达较正常组升高,疏肝健脾颗粒各剂量和三苯氧胺组均能够降低FasL蛋白的表达,与模型组比较,差异有显著统计学意义(P<0.05或P<0.01),与三苯氧胺组差异无统计学意义(P>0.05)。结果见图1～图2,表2。

图1 各组大鼠乳腺组织Fas蛋白表达的免疫组化检测结果(×400)

图2 各组大鼠乳腺组织FasL蛋白表达的免疫组化检测结果(×400)

表2 各组大鼠乳腺组织Fas、FasL表达的比较(个)

4 讨论

关于乳腺癌的癌前病变的界定,至今尚无统一的认识。普遍认为癌前期病变是指形成于恶性肿瘤之前,形态学出现不典型增生,或原位癌阶段,而组织尚不具备特征性的恶性改变或某些较容易发展成为癌的病变。乳腺癌癌前病变是介于乳腺增生向乳腺癌发展的过渡中间环节,病理变化有其特殊性,但乳腺癌癌前病变经过治疗尚可以阻断和逆转其进一步的发展。目前尚无特异性的方法和药物治疗乳腺癌癌前病变,手术治疗亦无明确的针对性,中医药治疗能够获得一定的疗效,因此积极寻求中医药干预治疗乳腺癌癌前病变的药物和方剂,对于乳腺癌的二级预防,降低乳腺癌的发生率,具有重要意义。

本病在中医学文献中无明确的概念,但在《疡科心得集》中有 “有乳中结核.形如丸卵,不疼痛,不发寒热,皮色不变,其核随喜怒而消长,从名乳癖”的描述,可与之对应。另一病症“乳岩”与“乳癖”亦有密切的关联,所以可归属于“乳癖”与“乳岩”的过渡阶段,即经过“量变”到“质变”的过程[8]。中医理论认为,乳癖病机多为肝失疏泄,乘脾克胃,气血运行不畅,郁久化热,灼津为痰,或冲任失调使气血瘀滞,痰湿内生,聚结于乳络而成。《医宗金鉴》曰：“乳中结核梅李形……症由肝脾郁结成”。乳癖发展为乳岩更多与情志因素有关,与肝脾关系密切。《外证医案汇编》云：“少阳行经之地,气血皆薄,加以情怀失畅,气血痹郁,故难治,日久恐成岩证”。这些论述提示其病因病机为情志失调,肝气郁结,乘克脾土,致使肝郁脾滞,脾失健运,聚湿成痰,痰瘀互结加速乳癖向乳岩转变。因此,乳腺癌癌前病变的治疗宜从肝脾论治,疏肝健脾为基本治则,辅以化痰散瘀,可庶免乳岩之变。

疏肝健脾颗粒方中柴胡、青皮疏肝理气,黄芪、茯苓益气健脾,莪术、薏苡仁化痰散瘀。全方及拆方研究对三阴性乳腺癌MDA-MB-231细胞、人乳腺癌MDA-MB-435S细胞有明显的增殖抑制效应,而且能够诱导凋亡;含药血清能够显著抑制MDA-MB-231细胞的迁移和侵袭能力[9-10]。动物移植瘤模型研究表明乳康饮对裸鼠乳腺原位移植瘤的生长和淋巴转移有显著的抑制作用,其作用机制为抑制乳腺癌组织VEGF-C/D、VEGFR-3 mRNA水平的表达和Ang-2 蛋白及mRNA水平表达,干扰 Ang-2/Tie2 信号通路,阻断VEGF-C、D/VEGFR-3信号通路的传导,阻碍乳腺癌组织的淋巴管生成,从而控制淋巴转移[11-12];而且只对PI3K/AKT通路中 PI3K、AKT 的表达起抑制作用,在促进上游 PTEN、SHIP 表达的同时,调控PI3K/AKT通路信号传导,抑乳腺癌的发生发展[13]。以上研究均集中在乳腺癌的研究,对于乳腺增生以及癌前病变尚未涉及。

本研究结果表明,疏肝健脾颗粒能够阻断DMBA诱导的大鼠乳腺癌癌前病变过程,表现为随着疏肝健脾颗粒剂量的增加,癌前病变和导管内癌的发生率逐渐降低,且与雌激素受体拮抗剂三苯氧胺作用相近。

Fas/FasL信号通路在细胞凋亡中发挥重要作用。Fas是死亡受体,表达于细胞表面,是细胞凋亡的主要信号通路因子,其天然配体FasL是肿瘤坏死因子家族中的Ⅱ 型跨膜蛋白,在激活的T细胞、巨噬细胞、NK细胞以及免疫赦免组织均有表达,生理条件下FasL与Fas结合后,可导致表达Fas的细胞凋亡[14]。许多恶性肿瘤组织中,包括乳腺癌组织均存在Fas表达的下调,相反FasL表达上调,因此由于肿瘤细胞表面Fas蛋白表达的缺失,导致了细胞凋亡受阻成为恶性肿瘤发生和发展的根源[15]。刘晓红等[16]通过研究发现Fas的表达情况,在不同的乳腺组织中有一定规律,正常乳腺组织中高于乳腺腺瘤和乳腺不典型增生,而乳腺癌组织中的表达最低; FasL的表达规律却相反,正常的乳腺组织中最低甚至不表达,乳腺腺瘤和乳腺不典型增生中有部分表达,而乳腺癌组织表达最高,因此推测乳腺癌的发生、发展等过程与细胞凋亡异常有密切关系。乳腺增生到乳腺癌的发生发展过程,最大可能的是以乳腺不典型增生为界限的细胞凋亡过程,增生至不典型增生的乳腺组织Fas的表达逐渐减少,而FasL的表达逐渐增加,细胞凋亡相对比较活跃,机体启动了细胞的凋亡机制,淘汰或清除过度增生的细胞和具有恶变倾向的细胞,从而尽可能地抑制乳腺组织过度增生而遏制其恶变的发生。

本文免疫组化结果显示,Fas蛋白表达在正常对照组大鼠乳腺组织中较高,在模型组表达较低,疏肝健脾颗粒有提升Fas表达的作用,与三苯氧胺组比较,差异无统计学意义(P>0.05);FasL蛋白表达与Fas相反,在模型组乳腺组织有较高表达,疏肝健脾颗粒各剂量组均能够降低FasL蛋白的表达,与三苯氧胺组比较无统计学差异(P>0.05);且随着疏肝健脾颗粒剂量的增加,对Fas、FasL的作用增强。由此推知,疏肝健脾颗粒通过干预乳腺组织Fas、FasL的表达,在大鼠乳腺癌癌前病变过程中,Fas/FasL通路启动了细胞凋亡机制,促进了乳腺组织细胞的凋亡,从有效地阻止乳腺组织的过度增生及癌变过程。