基于TLR4/NF-κB信号通路探讨川膝散对肾虚血瘀型膝骨性关节炎的作用机制

周晓成 ,项 杰,张姚萍,吴良金,孙风凡,夏晓斌,穆中杰

(杭州市富阳中医骨伤医院·浙江 杭州 311400)

膝骨性关节炎是临床常见的骨关节疾病,早期主要表现为膝关节负重活动时轻微疼痛,随着疾病的进展,出现静息状态下膝关节疼痛,甚至膝关节畸形、活动受限等症状,严重影响患者的日常生活[1]。西医药物保守治疗主要以抗炎炎镇痛类药物、关节腔注射等治疗为主,难以有效地控制膝骨性关节炎的进展,并且存在一定的副作用[2]。中医中药具有安全性高、多靶点治疗等优势,在骨伤科疾病的治疗中有广泛的应用。膝骨性关节炎属于中医“痹证”范畴,老年膝骨性关节炎多以肾虚为其本,而痹证日久易致瘀,从而形成肾虚血瘀这一虚实夹杂之证,临床上较为常见[3]。川膝散是本院张玉柱主任治疗膝骨性关节炎的经验方,临床应用疗效确切,但其作用机制尚不明确。本研究将探讨川膝散对肾虚血瘀型膝骨性关节炎TLR4/NF-κB信号通路的影响,为该药物的进一步开发利用提供依据。

1 临床资料

1.1 一般资料 纳入2021年1月—2022年12月至杭州市富阳中医骨伤医院就诊的膝骨性关节炎患者90 例。应用随机数字表法将患者分为对照组和观察组,每组各45例;其中5例中途主动要求退出,3 例不能按规定治疗接受其他治疗,3例无法坚持治疗,最终共纳入79例患者,其中对照组41例,观察组38例,组间一般资料比较差异无统计学意义,具有可比性(P>0.05),见表1。本研究经过杭州市富阳中医骨伤医院伦理委员会批准(厅浙中2020-02A号)。

表1 两组患者一般资料比较

1.2 诊断标准 西医诊断标准依据中华医学会骨科学分会关节外科学组制订的《骨关节炎诊疗指南(2018版)》[4],并根据Kellgren-lawrence 分级[5]对膝骨关节炎进行分级。中医证候诊断依据《中医骨伤科临床诊疗指南·膝痹病(膝骨关节炎)》[6]中肾虚血瘀证标准。

1.3 纳入标准 1)符合膝骨性关节炎诊断标准且Kellgren-lawrence 分级为I、II 级;2)VAS疼痛评分≥4 分;3)中医证候为肾虚血瘀型;4)年龄60～70 岁;5)签署知情同意书。

1.4 排除标准 1)类风湿、痛风、感染等其他疾病引起的膝关节炎;2)肢体畸形;3)存在神经系统疾病;4)既往膝关节手术史。

1.5 剔除及脱漏标准 1)未按规定治疗,无法判断疗效者;2)资料不全者;3)无法坚持治疗者;4)主动要求退出者。

2 方法

2.1 治疗方法 对照组：由专门医生对患者进行坐位股四头肌非负重训练的指导,每日训练3组,每组锻炼20次;应用氟比洛芬凝胶贴膏(北京泰德制药股份有限公司;批号：J20160090;规格：40 mg/贴×6 贴)外用,每日2次;口服硫酸氨基葡萄糖(浙江海正药业股份有限公司;批号：H20041316;规格：0.314 g×12粒×2板),2粒/次,每日3次。观察组：在对照组基础上予以内服川膝散(川牛膝15 g、桃仁10 g、红花6 g、当归10 g、赤芍12 g、生地15 g、防己10 g、延胡索10 g、泽兰10 g、黄柏8 g、赤小豆25 g组成),并辨证加减：肾阳虚加鹿角片10 g、补骨脂10 g;肾阴虚加龟甲10 g、枸杞12 g、女贞子12 g;血虚加阿胶10 g、熟地15 g、制首乌15 g;气虚加黄芪25 g、党参15 g;脾虚加党参15 g、白术15 g、炙甘草6 g;纳差加鸡内金9 g、焦三仙15 g;每日1 剂,每剂2 煎,均由本院煎药房统一标准煎制,分2次口服,共服用4 周。

2.2 观察指标及检测

2.2.1 膝关节疼痛评分 治疗前和治疗1个月后采用视觉模拟评分法(visual analogue scale,VAS)[7]评估,分值为0～10 分,0 分表示无痛,10分表示疼痛剧烈。

2.2.2 膝关节功能评分 治疗前和治疗1 个月后采用JOA评分[8]及WOMAC骨关节炎指数[9]评价。JOA评分包括步行疼痛、爬楼梯疼痛感、膝关节屈曲活动度及肿胀4 个部分,总分为100 分,分值越高代表膝关节功能越好。WOMAC骨关节炎指数评分由疼痛、僵硬程度、关节功能3 个部分组成,共28 个项目,分值越高表示膝关节功能越差。

2.2.3 血清TLR4、NF-κB p65、IL-1b、TNF-α检测 治疗前和治疗1个月后采取患者清晨空腹静脉血5 mL,以200 g离心力离心10 min,收集血清,采用酶联免疫吸附法检测血清TLR4、NF-κB p65、IL-1b、TNF-α水平,试剂盒购自上海达科为生物技术有限公司。

2.3 统计学处理 采用SPSS22.0统计学软件进行数据统计分析。计量资料经过正态分布检验符合正态分布,以均数±标准差表示,组间比较采用独立样本t检验,组内比较采用配对样本t检验;计数资料采用χ2检验。以P<0.05表示差异具有统计学意义。

3 结果

3.1 两组患者治疗前后膝关节疼痛和功能评分比较 见表2。

表2 两组患者治疗前后疼痛VAS、JOA及WOMAC评分比较分)

3.3 两组患者治疗前后TLR4/NF-κB 信号通路及炎症指标比较 见表3～表4。

表3 两组患者治疗前后血清TLR4、NF-κB p65比较

表4 两组患者治疗前后血清IL-1b、TNF-α水平比较

4 讨论

随着我国人口老龄化的加剧,膝骨性关节炎发病率逐年上升,已成为老年人群就诊最为常见的骨关节疾病。根据膝骨性关节炎的临床表现可归属于祖国传统医学“痹证”范畴。中老年患者肾气渐衰,先天之精匮乏无源,而肾主骨生髓,骨骼缺乏濡养,同时肾精不足,正气亏虚,易外感风、寒、湿外邪,闭阻于内,日久阻碍经脉气血的运行而致瘀,肾虚与血瘀互为交杂,相互影响,导致疾病迁延不愈,故治疗上应兼顾补肾益精和化瘀通络[10]。有学者在临床上应用补肾活血类中药治疗肾虚血瘀型膝骨性关节炎患者,发现补肾活血类中药可以起到减轻疼痛、改善膝关节功能的功效[11-12]。

本研究所应用的川膝散为国家非物质文化遗产项目“张氏骨伤诊疗技术”代表性传承人张玉柱主任经验方。方中川牛膝逐瘀通经兼顾补肝肾、强筋骨;桃仁、红花、延胡索活血化瘀止痛;当归行血补血;赤芍、生地清热凉血兼养阴生津;黄柏以泻火除蒸、解毒;防己、泽兰、赤小豆以行气利水为主,辅助活血,水行则血畅,增强活血功能[13]。研究结果显示川膝散治疗肾虚血瘀型膝骨性关节炎患者在治疗1个月后膝关节疼痛VAS评分低于对照组,前者的JOA评分高于对照组,WOMAC评分低于对照组;表明川膝散能有效缓解肾虚血瘀型膝骨性关节炎患者疼痛,改善膝关节的功能。

目前较为公认的膝骨性关节炎的发病机制是关节内机械损伤和慢性炎症相互作用的结果[14]。固有免疫系统的激活是引起关节内持续无菌性低度炎症反应的重要原因。Toll样受体(Toll like receptors,TLRs)是固有免疫反应中重要的一组跨膜分子,不仅参与了病原体相关分子模式蛋白的识别,其中部分TLRs还参与了损伤相关分子模式DAMPs蛋白的识别,TLRs与相关分子结合后能够激活下游NF-κB信号通路,诱导TNF-α、IL-6等促炎因子的释放;而关节内损伤的软骨碎片会被分解为纤维连接蛋白、透明质酸、二聚糖等物质,这些分解物能够与TLRs结合,从而激活固有免疫反应,诱发关节内的炎症反应,促炎因子的增多会促进基质金属蛋白酶的分泌,抑制胶原蛋白和蛋白聚糖的合成,促进软骨分解,限制软骨自我修复能力,导致关节内软骨进一步损伤[15]。在膝骨性关节炎模型来源的软骨和滑膜中均发现TLR4表达显著升高[15-16],相比其他模式识别受体,TLR4对DAMPs蛋白的识别更为敏感,这使得其更容易识别损伤软骨所分解的物质,诱发下游通路的激活[17]。RNA结合蛋白PUM1可以与TLR4的3’端非编码区结合,抑制TLR4 mRNA转录,Yoon DS等[18]通过过表达PUM1,抑制TLR4的合成,从而降低NF-κB的活性,保护细胞免受炎症介导的软骨形成表型的破坏。在IL-1β过表达的情况下,TLR4敲除的模型鼠软骨损伤程度和滑膜炎症均要弱于野生型鼠[19]。因此,TLR4对膝骨性关节炎固有免疫反应的激活具有重要意义。既往研究显示补肾活血类中药具有抑制炎症的作用[20-21],本研究结果显示,川膝散治疗的肾虚血瘀型膝骨性关节炎患者血清TLR4、NF-κB p65的表达相比对照组降低更明显,并且血清促炎因子IL-1b和TNF-α的含量也低于对照组;提示川膝散治疗肾虚血瘀型膝骨性关节炎的部分机制是通过抑制TLR4/NF-κB信号通路的激活,减少促炎因子的释放,从而起到减轻疼痛症状,改善患者膝关节功能的作用。

综上所述, 川膝散治疗可以调节TLR4/NF-κB信号通路,减少炎症因子产生,起到治疗肾虚血瘀型膝骨性关节炎的作用。