不同果色辣椒CCS 基因克隆及表达分析

李全辉,马玉杰,邵登魁,王亚艺,文军琴,钟启文

(青海大学 农林科学院/青藏高原种质资源研究与利用实验室,西宁 810016)

辣椒(CapsicumannuumL.)是茄科辣椒属一年或多年生草本作物,是中国栽培面积最大的蔬菜作物之一,也是重要的食品加工调味品;辣椒果实中含有丰富的维生素、类胡萝卜素、辣椒素等物质,具有良好的营养品质和保健功能[1];辣椒果实颜色是重要的商品性状之一,目前已经选育出各种不同果色的辣椒新品种。辣椒果实颜色的形成与果肉细胞中花色素、类胡萝卜素和叶绿素等的种类及含量密切相关。成熟辣椒果实中的主要色素类胡萝卜素[2-3],是一种脂溶性色素,植物花、叶、果等组织的着色与积累类胡萝卜素的类型及含量密切相关[4],随着辣椒果实的成熟,类胡萝卜素不断累积,叶绿素和花青素逐渐降解而呈现出不同的果实颜色。在成熟果色为红色的辣椒中主要含有辣椒红素、β-隐黄素、β-胡萝卜素、辣椒玉红素、玉米黄素、花药黄质和α-胡萝卜素等色素;黄色果实中,主要含有紫黄质、叶黄素、α-胡萝卜素、β-胡萝卜素、玉米黄素、花药黄质和β-隐黄素等色素;橙色辣椒含有辣椒红素、β-隐黄素、玉米黄质、紫黄质、α-胡萝卜素、β-胡萝卜素和玉米黄素等[5-9]。在辣椒作物中,CCS基因在辣椒红素合成的最后阶段催化5,6-环氧玉米黄质和紫黄质分别转化为辣椒红素和辣椒玉红素,是辣椒红素/玉红素合成的限速酶之一[8-9],在辣椒果实颜色形成过程中具有重要的作用。

辣椒成熟果实颜色主要受y、cl、c1和c2位点所控制,它们之间的相互作用导致辣椒果实产生不同的成熟果实颜色[10]。Huh等[11]利用不同果色辣椒进行遗传定位分析,将控制辣椒果实颜色的c2位点定位于第4条染色体,并最终确定c2位点与八氢番茄红素合成酶基因(PSY)共分。cl位点与CaSGR基因密切相关,通常在辣椒果实成熟过程中,由于叶绿素分解为无色产物,绿色被降解,而CaSGR基因的突变,使果实成熟过程中叶绿素降解能力受到抑制,辣椒果实因同时含叶绿素和不同成分的类胡萝卜素而呈棕色(或绿色)[12-13]。现有研究结果表明,y位点为CCS基因。

辣椒红素和辣椒玉红素是辣椒果实呈现红色的主要色素,前期研究认为辣椒成熟果红色对黄色为显性,是由单基因y调控,黄色果实可能是由于CCS基因的缺失形成[14-17];Popovsky 等[18]、Ha等[5]、Rodriguez-Uribe等[19]通过研究也进一步证实CCS基因的移码突变、单碱基突变等导致翻译提前终止,进而导致不同果色形成。Deruere等[20]研究表明CCS基因只在成熟红色果实中表达,辣椒植株叶片、青熟期和黄色辣椒果实各发育时期均未表达;Tian等[21]研究表明,CCS等基因参与辣椒果实类胡萝卜素的生物合成,其表达水平影响辣椒成熟果实的颜色,通过VIGS基因沉默技术也证实这一点。而张芳芳等[22]发现在一些黄色果实也有微量辣椒红素的存在;Popovsky等[18]研究认为黄色辣椒果实中是由于CCS基因5′部分序列缺失导致的,由此可见,不同果色辣椒果实中CCS基因变异及表达水平并不一致。

本研究以不同果色辣椒为材料,克隆CCS基因并进行序列分析,同时研究其在不同组织以及果色不同发育时期的表达情况,初步阐述不同果色形成和辣椒类胡萝卜素代谢密切相关的CCS基因序列及表达差异,以期为后续相关基因功能和调控机理研究奠定基础。

1 材料和方法

1.1 试验材料

供试材料为观赏椒GS6和Z1,甜椒SP01以及黄色突变体SP02,由西北农林科技大学园艺学院蔬菜生物技术与种质资源创新实验室和青海省农林科学院园艺研究所提供。2019年12月初将供试种播种于72孔穴盘中,2020年3月将辣椒幼苗移栽入基地大棚。根据花后不同时间将果实发育分为5个时期:Ⅰ期(10DAF)、Ⅱ期(20DAF)、Ⅲ期(30DAF)、Ⅳ期(40DAF)、Ⅴ期(50DAF),见图1。采集成熟期(50DAF)根、茎、叶、花及果实不同发育时期的样品,液氮速冻后-80 ℃贮藏备用。

图1 试验材料Ⅰ_Ⅴ(10 DAF-50 DAF) represent fruits at 10 d,20 d,30 d,40 d and 50 d after flowering,respectively.Fig.1 Experimental materials

1.2 试验方法

1.2.1类胡萝卜素关键基因全长克隆

在NCBI 数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中下载辣椒已有CCS基因序列,利用primer5.0软件根据不同用途设计引物(表1),以GS6和Z1 材料的gDNA 为模板进行基因全长扩增[23]。PCR 反应体系为:2×Es Taq Master Mix(Dye) 25 μL,10 mmol/L上下游引物各2 μL,DNA 1 μL(200 ng/uL),加水至50 μL 体系。PCR 反 应程序:98 ℃预变性5 min,98 ℃变性30 s,62 ℃退火30 s,72 ℃延伸2 min,共35 个循环,72 ℃延伸5 min。

扩增后的PCR 产物使用胶回收试剂盒(TaKa-Ra,大连)得到目的基因片段,连接到PMD19-T 载体(TaKaRa,大连),然后转入DH5α 感受态细胞中,最后将菌液检测呈阳性的单克隆送至华大基因股份有限公司进行测序。

1.2.2生物信息学分析

采用DNAman8.0软件对测序结果进行氨基酸序列、亲疏水性分析及同源序列比,利用ExPaSy-ProtParam(https://web.expasy.org/protparam)、SignaIP6.0(https://services.healthtech.dtu.dk/services/SignalP-6.0)、Euk-mPLoc2.0(http://www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/euk-multi-2)、TMHMM2.0(https://services.healthtech.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/)、SOPMA(https://npsapbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl? page=npsa_sopma.html)、SWISS-MODEL(https://swissmodel.expasy.org/)等在线工具分析蛋白质结构及理化性质,利用NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)预测蛋白质保守域,最后用MEGA7.1软件进行同源蛋白的系统进化树分析[24-25]。

1.2.3 CCS 基因表达分析

根据表1 所设计引物,以GS6、Z1、SP01 和SP02在果实不同时期和Ⅴ期不同组织的cDNA 为模板,辣椒UBI3基因为内参基因[26],使用Light Cycler480 Ⅱ进行qRT-PCR,反应体系(20 μL):2×SYBR Premix Ex Taq 10 μL、10 mmol/L上下游引物各0.6 μmol/L、cDNA 1 μL(100 ng/μL)模板、ddH2O 6.8 μL。反应程序:95 ℃ 3 min;95 ℃ 30 s;60 ℃ 30 s,72 ℃ 45 s,循环45次;72 ℃ 2 min。参照吕文远等[27]定量方法对基因进行实时荧光定量分析,3次生物学重复。采用2-ΔΔCT 方法进行数据计算处理。

2 结果与分析

2.1 类胡萝卜素CCS 基因的克隆

采用同源克隆策略,辣椒CM334 为参考基因组序列,以辣椒GS6、Z1、SP01、SP02叶片DNA 为模板,扩增CCS基因全长。电泳结果表明,在红色辣椒材料GS6、Z1、SP01中均能扩增到1 500 bp左右的基因片段,与预期大小相符,而在黄色突变体SP02中未能扩增出CCS基因(图2);将目的基因纯化、克隆测序后进行序列比对,结果显示CCS基因在GS6、Z1、SP01及参考基因组CM334中的序列均完全一致。

图2 辣椒CCS 基因PCR 扩增Fig.2 PCR amplification of CCS gene in pepper

基因结构分析结果表明,CCS基因只包含1个开放阅读框序列,没有内含子序列,全长为1 497 bp,编码498个氨基酸(图3)。

图3 CCS cDNA 序列及预测氨基酸序列Fig.3 CCS nucleotide sequence and predicted amino acid sequence

2.2 辣椒CCS蛋白的理化性质分析

利用ExPaSy-ProtParam 对CCS蛋白进行预测分析,结果表明:CCS蛋白分子式为C1780H2889N485O536S16,分子量为56 658.66 D,理论等电点为8.77,亲水性平均系数为-0.216,不稳定系数为44.5,预测该蛋白是一个不稳定蛋白(不稳定系数＞40);SignaIP 6.0预测结果显示该蛋白无信号肽,不属于分泌型蛋白;TMHMM2.0 预测该蛋白无跨膜螺旋区;Euk-mPLoc2.0 亚细胞定位预测结果显示CCS 蛋白于叶绿体的可能性较大。

2.3 氨基酸亲水性和疏水性预测

通过DNAMAN8.0 对辣椒CCS基因推导的氨基酸序列进行亲水性/疏水性分析。结果(图4)表明,该蛋白的第447位组氨酸(His)亲水性最强;疏水性最强的位点为第84位的缬氨酸(Val)。

图4 辣椒CCS氨基酸序列的亲水性和疏水性分析Fig.4 Hydrophilicity and hydrophobicity analysis of CCS amino acid sequence in C.annuum

2.4 辣椒CCS蛋白结构分析

利用SOPMA 预测CCS蛋白二级结构,结果如图所示(图5,A),CCS蛋白的二级结构主要由α-螺旋(33.54%)、延伸结构(16.47%)、β-折叠(3.21%)和无规则卷曲(44.78%)构。利用SWISS-MOEL在线软件进行蛋白三级结构同源建模和分析(图5,B),其结果显示CCS蛋白模型构建基于模板4opg.1.A(保守古菌蛋白),GMQE(global model quality estimate)得分0.33,覆盖率为64%,且辣椒CCS蛋白的三维结构由8个α-螺旋和15个β-折叠所构成。

图5 CCS蛋白二级(A)、三级(B)结构预测Blue parts represent alpha helix,red parts represent beta-pleated sheet,green parts represent beta turn,purple parts represent random coil.Fig.5 Prediction of secondary (A) and tertiary (B) structure of CCS protein

2.5 保守域分析与同源性序列比对

在NCBI保守域数据库中将辣椒CCS 氨基酸序列进行保守域预测可知,CCS包含番茄红素β-环化酶(PLN02463)结构域和番茄红素环化酶(Lycopene_cycl)结构域的特异位点,编码氨基酸起止分别为53-497位和83-478位,属于NADB_Rossmann、Lycopene_cycl超家族,表明CCS 蛋白具有番茄红素环化酶家族蛋白(结构域ID 10010798)典型的保守区域(图6)。

图6 辣椒CCS蛋白氨基酸序列保守域预测Fig.6 Prediction of conserved domain of amino acid sequence of CCS protein in Capsicum annuum

将辣椒(C.annuum)CCS 氨基酸序列XP_016577952.1 分别与中华辣椒(C.chinense)PHU16032.1、灯笼辣椒(C.baccatum)PHT30120.1、潘那利番茄(Solanumpennellii)NP_001310372.1、绒毛烟草(Nicotianatomentosiformis)XP_009609006.1、棉花(Gossypiumlaxum)MBA0713011.1、宁夏枸杞(Lyciumbarbarum)AIX87499.1、黑果枸杞(L.ruthenicum)AIX87523.1、茶 (Camelliasinensis)KAF5937613.1、番茄(S.lycopersicum)CAB93342.1、杏(Prunusarmeniaca)CAB4283368.1、麻风树(Jatrophacurcas)XP_012070159.1 和三裂叶薯(Ipomoeatriloba)XP_031113926.1等植物的CCS氨基酸序列进行多重比较分析(图7),发现序列比对的一致性依次达到99.4%、99%、86.75%、85.37%、69.88%、85.14%、85.34%、71.89%、85.54%、69.08%、71.08%、72.55%,共同一致性达到84.98%,表明辣椒CCS氨基酸序列与这12个物种都具有较高的同源性,且不同物种的CCS氨基酸序列的保守性均较高。

图7 辣椒与其他植物CCS蛋白氨基酸序列的多重比对Fig.7 Multiple alignment of amino acid sequences of CCS protein between C.annuum and other plants

2.6 进化树分析

利用MEGA7.1将辣椒与其他12种不同植物构建同源进化树。结果(图8)显示,辣椒与同属茄科的宁夏枸杞(L.barbarum)、黑果枸杞(L.ruthenicum)、绒毛烟草(N.tomentosiformis)、中华辣椒(C.chinense)和灯笼辣椒(C.baccatum)在进化上属于同1个分支,且与同科同属的中华辣椒(C.chinense)在进化关系上最为接近。

图8 辣椒与其他物种CCS蛋白氨基酸序列的系统进化树Fig.8 Phylogenetic tree of amino acid sequences of C.annuum and other plant CCS proteins

2.7 辣椒CCS 基因在不同组织的表达分析

研究采用qRT-PCR 技术对CCS基因在GS6、Z1、SP01和SP02不同组织中表达模式进行分析,以辣椒CCS基因在根中的相对表达量作为参考。

结果显示,CCS基因在GS6和Z1的根、茎、叶、花、果等不同组织中均有表达,而在SP01的茎和叶以及SP02 的所有组织中均未表达;其中,在GS6中,CCS基因在花中的表达量最高,显著高于其他组织;在Z1和SP01中,CCS基因在果实中的表达量显著高于其他组织,在根中表达量最低(图9,A)。

图9 辣椒不同组织及果实不同时期CCS 基因的相对表达水平Different normal letters mean significant difference at 0.05 level.Fig.9 Relative expression levels of CCS gene in different tissues of pepper and different periods of pepper fruit

2.8 CCS 基因在辣椒果实不同发育时期的表达分析

对CCS基因在GS6、Z1、SP01和SP02果实发育时期中的表达模式进行分析。结果(图9,B)显示,CCS基因在黄色突变体SP02各组织均未表达;在GS6与SP01中随果实发育表达量逐步上升,分别在Ⅳ期(40DAF)和Ⅲ期(30DAF)达到最大值,而后表达量逐渐下降;在Z1中,CCS基因随着果实发育,表达量逐步升高,在前3个时期(Ⅰ-Ⅲ期)表达量较低,Ⅳ期表达量大幅上升,Ⅴ期达到最大值,且显著高于其他几个时期。表明CCS基因对辣椒红、黄果色的形成具有重要作用且主要在果实成熟阶段表达。

3 讨论

辣椒果色丰富多彩,已经成为研究果色遗传的一种模式植物[28]。类胡萝卜素作为辣椒花和果实的主要色素,在辣椒果实发育过程中,类胡萝卜素的组成及含量不同影响辣椒果实的色泽[29]。前人研究结果表明,CCS基因在类胡萝卜素的合成及辣椒果色形成中发挥着重要作用,Lang等[30]以红果与黄果辣椒杂交分离后代作为研究材料,利用薄层色谱对类胡萝卜素组成成分进行分析,结果表明成熟红果的类胡萝卜素中辣椒红素占比最高,而在成熟色为黄色辣椒的类胡萝卜素中则不含辣椒红素,同时在对红色与黄色果实CCS基因验证中发现,红果中含有完整CCS基因,而黄果CCS基因的PCR 带型呈现多态性且在上游区域,CCS基因有缺失。田士林[17]通过对红色辣椒果实类胡萝卜素生物合成通路上关键基因CCS等进行基因沉默时,发现组成类胡萝卜素的各相关色素含量在不同程度上都有所降低,其中辣椒红素含量降低更加明显,这也进一步证实了CCS基因与辣椒果色密切相关。本试验从3个成熟果色为红色的不同品种辣椒中均能克隆到完整的CCS基因,条带大小为1 497 bp,与参考基因组CM344序列100%相匹配,而在成熟果色为黄色的SP02中未能扩增出CCS基因,表明在成熟色为红色的GS6、Z1和SP01辣椒中,CCS基因具有完整的序列,而SP02(黄色)果色的形成可能与CCS基因的缺失或变异密切相关,这对于了解CCS基因功能,为进一步深入解析辣椒果色形成机理,以及不同果色辣椒新品种选育具有重要意义。

在有关辣椒红、黄色果实颜色形成的研究中,诸多研究表明CCS基因的结构变异是导致辣椒果实颜色发生改变的重要影响因素之一,其中CCS基因编码区中碱基缺失、碱基突变以及移码突变等,提前产生终止密码子,导致CCS基因功能受损,进而影响辣椒果实颜色的形成。启动子是位于基因5′端上游的一段DNA 序列,主要参与基因的表达调控[31],Ha等[5]通过研究不同果色CCS基因的编码区和启动子区,发现在不同辣椒中CCS基因启动子区可分为920/922 bp、998/999 bp、1 175 bp 3种模式,且在成熟果实颜色为黄色辣椒的PCR 带型中也存在CCS基因的编码区和启动子区,将其与完整CCS编码区的核苷酸序列进行多次比对,结果表明:黄色果实‘Y2’的CCS基因在1 431 bp处插入8 bp,造成移码突变,转录提前终止;‘Y3’的CCS基因在599 bp处发生单碱基(C/A)突变,形成提前终止密码子,使辣椒红素合成无法进行,致使果实呈现黄色。陈奕聪等[32]利用2种不同成熟色(红果和紫果)的辣椒,对其不同发育时期果实进行表达分析,结果显示,成熟色为红色的辣椒果实中CCS基因有较高的表达量,而在紫色辣椒中,果实发育各时期均不表达或者表达量极低。由此可见,辣椒不同果实颜色的形成与CCS基因的序列变异和表达量密切相关。本研究所选用的GS6、Z1、SP01和SP02中,红果材料中CCS基因的序列均不存在变异,而黄果材料中未能克隆出CCS基因,同时CCS基因在不同组织和果实不同发育时期的表达量存在显著差异,说明在CCS基因的差异调控模式在GS6、Z1、SP01和SP02 果色形成过程中具有重要的作用。本研究结果对深入开展相关基因功能,进一步阐述辣椒不同果实颜色形成的分子机制,实现辣椒分子辅助育种具有重要意义。