DNA 检测技术分析血迹陈旧度的初探*

李海霞 彭 颖 李晨华 李学刚

（广东警官学院刑事技术系，广东 广州 510440）

利用DNA 分析技术检测陈旧血迹的DNA，通过DNA 的数量和质量分析，了解血迹DNA 的降解过程，目前研究主要集中于不同载体对DNA 降解的影响及存储DNA 的状态效果［1-2］。其中，A.L. Rahikainen 等利用存储16 年的FTA 血卡研究DNA 的质量变化，评估依赖于时间的降解情况，从1998 年到2013 年的8 个时间点随机采集了4 个FTA 样本，采用Quantifiler®Human Plus (HP)定量试剂盒测定提取DNA 样品的数量和质量，证明FTA 卡存储效果较明显，DNA 较为稳定。然而国内外关于利用DNA 检测技术判断血迹陈旧度的研究较为鲜见。

本研究通过直扩法、Chelex-100 提取法、磁珠提取法等DNA 检测方法对陈旧血迹进行DNA 质与量检测，比较分析各自图谱的均衡性，峰值、峰面积的差异性等，得出利用DNA 检测技术对血迹陈旧度的初步探索。

1 材料与方法

1.1 材料

收集2009 ～ 2018 年每年度各2 份血滤纸检材，共20 份血滤纸检材，均为本鉴定中心日常检案的检材。

1.2 方法

根据《法庭科学DNA实验室检验规范》（GA/T383-2014）标准，通过直扩法、Chelex-100 提取法、磁珠提取法等3 种不同的DNA 分析方法对陈旧的血滤纸进行检测。采用1.2mm 打孔器对20 份血滤纸检材进行取样，其中，直扩法取1 片血滤纸，Chelex-100 提取法与磁珠提取法取3 片血滤纸，同时，加入10%的Chelex-100悬液为30µL，磁珠提取法的洗脱液亦为30µL，其余步骤按照试剂说明书进行规范操作提取DNA。采用GoldeneyeTM DNA 身份鉴定系统 20A 试剂盒（基点认知，北京，简称20A）进行扩增，2 种方法均为全模板扩增，即加入3.84µL 的DNA 提取液，扩增热循环数为30 个循环，其余步骤按照商业试剂盒说明书进行操作。采用ABI-3130 遗传分析仪进行电泳分离和基因分型。利用GeneMapper®ID V2.0 软件进行分型结果的分析。

2 结果

因血滤纸检材的放置年份长久，取样面积并不多，为了确保基因分型的准确性，每个血滤纸检材所得基因分型均与之前检案的图谱进行比较，血滤纸检测所得图谱（见图1 ～图2）。从不同年份图中的峰高值和峰面积值可以看出，血滤纸存在降解趋势，年份越久降解趋势越明显。按照265bp 作为大小片段的分界线，将各个基因座分为小片段基因座和大片段基因座，即小片段基因座包含D19S433、D5S818、D21S11、D3S1358、D13S317、D7S820、AMEL、vWA、D8S1179、TH01、D12S391 和D2S1338，大片段基因座包含D18S51、D6S1043、D16S539、CSF1PO、Penta D、TPOX、Penta E 和FGA，3 种方法的大小片段的峰高值和峰面积值（见表1 ～表3）。从表1 可以看出，无论是大片段还是小片段，直扩法的峰高值和峰面积值是最高的，其次是磁珠提取法，最低是Chelex-100 提取法。不同年份的大小片段峰高值和峰面积值的比值（见表4），从表2 可以得出，直扩法、Chelex-100提取法和磁珠提取法的峰高比值分别为3.24、4.13、3.31，同理，峰面积比值分别为2.81、3.57、2.81，直扩法和磁珠提取法的峰高和峰面积比值相当，而Chelex-100 提取法的峰高和峰面积比值差异大些。

图1 检材编号为1 的图谱

图2 检材编号为18 的图谱

表1 不同年份检材直扩法的峰高和峰面积（单位：千）

表2 不同年份检材Chelex-100 提取法的峰高和峰面积（单位：千）

表3 不同年份检材磁珠提取法的峰高和峰面积（单位：千）

表4 不同年份的大小片段峰高值和峰面积值的比值

3 结论

直扩法、Chelex-100 提取法和磁珠提取法是目前最为常用的DNA 提取法。直扩法可以达到简化实验步骤，缩短检验时间、减少污染、节约检材和成本的效果，但是对于杂质较多或降解较为严重的检材，直扩法不一定是最佳选择［3-4］；Chelex-100 提取法可以做到DNA 量无损失，对于污染轻、杂质少的接触DNA 检材用此法提取出的DNA 片段更加完整，但在实验过程中，Chelex-100 法却不能有效地排除DNA 混有的杂质和降解的DNA 碎片的干扰［5］；磁珠提取法可有效去除检材中的杂质，提高DNA 的质量，并在降解和腐败检材上的处理略胜一筹，但在去除杂质的同时，会对DNA 存在的量造成一定的损失，对于微量检材是不利的［6］。3 种不同的DNA 检测方法存在各自的优缺点，根据不同条件的检材选择合适的DNA 检测方法进行分析。

本研究通过3 种不同的方法分析血迹陈旧度，从图谱可以看出，与大片段的峰高值和峰面积相比，小片段均高些，而且越久年份的血滤纸降解程度越明显，从而说明用DNA 检测方法去分析血迹陈旧度是可行的，图谱结果可以明显得出结论。

从检测结果的均衡性、峰高比值和峰面积比值来看，直扩法对于2009 ～ 2018 年血滤纸检材的检测，在同等条件之下，较其他两种方法，其检测的峰高值和峰面积是最高的，检测效果是最好的，长达14 年的血滤纸依然能检测出较为完整的图谱。假设3 片血滤纸的DNA 含量为100%，直扩法1 片血滤纸的DNA 含量为33%，而Chelex-100 提取法和磁珠提取法仅为12.8%，排除其他因素的影响，DNA 含量的不同直接影响图谱的结果。因检材量有限，未能做到DNA 含量精准相同，若检材条件允许的情况下，可进一步研究。

从血滤纸的保存年份进行分析发现，普遍是年份越久的，峰高和峰面积的均值越大，比值亦越大。同时，亦发现2011 年和2012 年度的血滤纸检材与这个结论不符，无论哪种DNA检测方法，这4 个检材的峰高和峰面积的比值均变化较大，是检测保存条件的问题还是提供血液的个体差异问题，原因仍需进一步探讨。