棉酚对雄性肉仔鸡生长性能、血清抗氧化能力及肾脏病理组织形态的影响

李啊诗，刘 盼，张新楠，胡雨露，李玉杰，赵 扬，吴尚泽，贺建忠，张梦迪

（塔里木大学动物科学与技术学院，新疆 阿拉尔 843300）

我国是世界上最大的棉花生产国， 全国大部分地区都有棉花种植， 新疆维吾尔自治区是我国棉花主产区，2022 年产量已经占到全国棉花总产量的87.7%［1］。副产品棉籽经加工可制成粗蛋白含量高达40%～45%的棉籽粕饼，是一种物美价廉的非常规植物蛋白饲料原料［2］， 但棉籽粕中含有游离棉酚（free gossypol，FG）和多种抗营养因子，营养成分不平衡，这使其在肉鸡饲料中的应用受到极大的限制［3］。 FG 的过量摄入不仅造成家禽肝脏和肾脏损伤、生产力下降，还导致中毒，严重时出现猝死，甚至可通过食物链危害人类健康［4］。 《饲料卫生标准》（GB 13078—2017）［5］规定家禽（产蛋禽除外）配合饲料产品中FG 的限量值≤100 mg/kg。 目前关于棉酚对肉仔鸡的作用研究大多集中于生理学和形态学方面， 对机体抗氧化能力的影响研究并不全面，致病机理也不清楚。 研究发现氧化应激是导致疾病发生的关键因素之一。 当机体抗氧化能力减弱或体内活性氧自由基水平异常增加时，会引起细胞死亡，甚至导致机体各组织脏器的损伤［6-7］。 棉酚已被证明可以诱导多种动物的脏器损伤，降低生产性能，增加死淘率［8-11］。 为了解棉酚的不当添加对肉仔鸡在生理学、组织学水平的毒性作用和对实质性器官抗氧化能力的影响，本研究通过给肉仔鸡灌服不同浓度棉酚，建立棉酚中毒的病理模型，观察不同剂量棉酚对不同生长阶段肉仔鸡生长性能、血清抗氧化能力及肾脏病理组织形态的影响，以期为棉籽粕在肉鸡养殖中的合理应用积累基础试验数据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 试验动物

48 只同批次1 日龄健康良凤花雄性肉仔鸡，购自新疆维吾尔自治区阿克苏地区某种鸡场。

1.1.2 主要试剂

醋酸棉酚，购自成都康邦生物科技有限公司，纯度为98%。根据现配现用原则，用蒸馏水将醋酸棉酚稀释成20 mg/mL 的棉酚稀释液，按照相应平均体重给肉仔鸡灌胃。 血清过氧化氢酶（catalase，CAT）和谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）检测试剂盒，购自索莱宝物科技有限公司。

1.1.3 主要仪器设备

SYNERGY 型酶标仪，美国伯腾仪器有限公司产品；DM750 型显微镜，德国徕卡相机股份公司。

1.2 试验方法

1.2.1 试验设计

采用单因素完全随机试验设计， 根据体重相近原则，将48 只肉仔鸡分为4 组：对照组（C）、低剂量组（L）、中剂量组（M）、高剂量组（H），每组4个重复， 每个重复3 只。 在饲喂基础日粮的基础上，C 组以及L 组、M 组、H 组每天8:00 分别灌胃蒸馏水以及100、150、200 mg/（kg·BW）棉酚1 次，直至20 日龄，共灌胃20 d。 基础日粮组成及营养水平见表1。

1.2.2 饲养管理

试验在塔里木大学动物试验站进行。鸡舍、鸡笼充分消毒， 试验肉仔鸡在温度28～35 ℃、 湿度50%～70%和充足光照等条件下， 分别在标有C组、L 组、M 组和H 组标记的鸡笼中分笼饲养，每笼12 只鸡，自由进食、饮水。每日观察肉仔鸡健康状况，并做好记录。 全期不进行免疫。

日粮组成玉米/%豆粕/%玉米蛋白粉/%花生粕/%豆油/%小麦/%鱼粉/%石粉/%磷酸氢钙/%食盐/%预混料/%合计含量55.00 17.50 6.50 6.00 3.50 5.50 2.00 1.50 1.20 0.30 1.00 100营养水平代谢能/（MJ/kg）粗蛋白/%粗纤维/%蛋氨酸/%赖氨酸/%钙/%总磷/%含量11.83 19.50 5.00 0.45 1.10 0.60～1.20 0.45

1.2.3 血液及肾脏组织样品采集

分别于6、11、16 和21 日龄进行样品采集：采样前1 天晚上从每组随机选取3 只体重接近组内平均体重的肉仔鸡禁水禁食，采样当天8：00对肉仔鸡空腹称重并记录后，颈静脉采血，血液样本静置30 min，3 000 r/min 离心10 min， 分离血清并置于-20 ℃冰箱保存备用。 采血后对鸡只进行安乐死处理，用镊子摘取肾脏，剪取大小适合（2.0 cm×2.0 cm×0.3 cm）的肾脏组织，用滤纸吸取表面血液后放入4%多聚甲醛溶液中固定保存。

1.2.4 指标测定

1.2.4.1 生长性能指标

每天8：00 对肉仔鸡称重并记录后，进行棉酚灌服， 当天23：00 记录各组鸡只的采食量后供应饲料，全天水、料不限量。 计算平均日增重（average daily gain，ADG）和平均日采食量（average daily feed intake，ADFI）， 然后计算料重比（feed to gain ratio，F/G）。 肉仔鸡死淘时记录死淘鸡只体重和该栏剩余饲料重，用于校正生长性能数据。

1.2.4.2 血清抗氧化能力指标

将保存的血清进行抗氧化酶GSH-Px 和CAT 的活力测定，所有操作均按照试剂盒说明书步骤进行。

1.2.4.3 肾脏病理组织切片的制备及观察

将采集的肾脏组织制作HE 染色切片（haematoxylin and eosin，HE）， 观察肾脏的组织病理学变化。将固定的组织从多聚甲醛中取出，经冲洗、脱水、透明、浸蜡、修整切块后，再将修整好的组织块放入石蜡中包埋，然后切片。在切片机上将组织块切成5～6 μm 厚的切片，然后经过二甲苯和不同梯度的酒精（100%～70%）脱水透明，再用苏木素-伊红染色，最后用中性树胶封片，在三目显微镜下观察。

1.3 数据统计分析

生长性能和血清抗氧化酶活力试验数据经Excel 2019 软件初步整理后，采用Graphpad Prism 5 统计学软件， 先进行One-Way ANOVA 单因素方差分析， 然后采用Tukey′s Multiple Comparison Test 进行组间多重比较。P<0.05 认为差异显著，P<0.01 认为差异极显著，P>0.05 认为差异不显著。

2 结果与分析

2.1 棉酚对雄性肉仔鸡生长性能的影响

由图1 可知，1～20 日龄阶段，L 组的料重比呈上升趋势，H 组的料重比呈波动性变化， 二者的料重比均高于C 组；M 组的料重比在1～15 日龄呈上升趋势，其间料重比高于C 组，但在16～20 日龄呈负增长。

图1 1～20 日龄各组肉仔鸡料重比的变化趋势

由图2A 可知，1～5 日龄阶段，L 组、M 组和H组的料重比极显著（P<0.01）高于C 组，L 组、M 组和H 组之间差异不显著（P>0.05）；由图2B 可知，6～10 日龄阶段，L 组、M 组和H 组的料重比极显著 （P<0.01） 高于C 组，M 组和H 组极显著 （P<0.01）高于L 组，H 组极显著（P<0.01）高于M 组；由图2C 可知，11～15 日龄阶段，L 组、M 组和H 组的料重比极显著（P<0.01）高于C 组，M 组极显著（P<0.01）高于L 组和H 组，H 组显著（P<0.05）高于L 组；由图2D 可知，16～20 日龄阶段，L 组和H组的料重比极显著（P<0.01）高于C 组，H 组极显著（P<0.01）高于L 组，M 组的料重比呈负增长，与C 组，L 组和H 组差异极显著（P<0.01）。

图2 不同剂量棉酚对不同生长阶段雄性肉仔鸡料重比的影响

2.2 棉酚对雄性肉仔鸡血清抗氧化能力的影响

2.2.1 棉酚对雄性肉仔鸡血清CAT 活力的影响

由图3 可知，6～21 日龄阶段，C 组的血清CAT活力呈上升趋势，L 组、M 组和H 组的血清CAT活力呈下降趋势；6 日龄时，L 组、M 组和H 组的血清CAT 活力高于C 组；之后随着灌胃天数的增加，L 组、M 组和H 组的血清CAT 活力均低于C组；11～21 日龄阶段，M 组的血清CAT 活力下降幅度大于L 和H 组。

图3 6～21 日龄雄性肉仔鸡血清CAT 活力的变化趋势

由图4A 可知，6 日龄时，L 组、M 组和H 组的血清CAT 活力均高于C 组，H 组的血清CAT 活力最高，显著（P<0.05）高于C 组；由图4B 可知，11日龄时，L 组、M 组和H 组的血清CAT 活力均低于C 组，L 组的血清CAT 活力最低，显著（P<0.05）低于C 组；由图4C 和4D 可知，16 日龄和21 日龄时，L 组、M 组和H 组的血清CAT 活力均极显著（P<0.01）低于C 组。6、11、16 和21 日龄时L 组、M组和H 组的血清CAT 活力两两相比差异均不显著（P>0.05）。

图4 不同剂量棉酚对不同日龄雄性肉仔鸡血清CAT 活力的影响

2.2.2 棉酚对雄性肉仔鸡血清GSH-Px 活力的影响

由 图5 可 知，6～21 日 龄 阶 段，C 组 的 血 清GSH-Px 活力呈上升趋势，L 组、M 组和H 组的血清GSH-Px 活力呈下降趋势；6 日龄时，L 组、M 组和H 组的血清GSH-Px 活力稍高于C 组，但各组差距不明显； 之后随着灌胃天数的增加，L 组、M组和H 组的血清GSH-Px 活力均低于C 组，L 组的血清GSH-Px 活力稍高于M 组和H 组，而M 组和H 组的血清GSH-Px 活力差距较小。

图5 6～21 日龄雄性肉仔鸡血清GSH-Px 活力的变化趋势

由图6A 可知，6 日龄时，L 组、M 组和H 组的血清GSH-Px 活力均稍高于C 组， 各组差异不显著（P>0.05）；由图6B 可知，11 日龄时，L 组的血清GSH-Px 活力显著（P<0.05） 低于C 组，M 组和H组的血清GSH-Px 活力极显著 （P<0.01） 低于C组，L 组、M 组和H 组之间两两比较差异不显著（P>0.05）； 由图6C 可知，16 日龄时，L 组、M 组和H 组的血清GSH-Px 活力均极显著（P<0.01）低于C 组，L 组、M 组和H 组之间两两比较差异不显著（P>0.05）； 由图6D 可知，21 日龄时，L 组、M 组和H 组的血清GSH-Px 活力均极显著（P<0.01）低于C 组，L 组的血清GSH-Px 活力显著（P<0.05）高于H 组，极显著（P<0.01）高于M 组。

图6 不同剂量棉酚对不同日龄雄性肉仔鸡血清GSH-Px 活力的影响

2.3 肾脏病理组织学分析

由图7A 可知，21 日龄时，C 组肉仔鸡的肾脏结构完整， 肾小管和肾小球发育良好， 无明显病变；L 组、M 组和H 组肉仔鸡的肾脏存在明显的病理学变化（见图7B、图7C、图7D）：肾小球肿胀，肾小囊间隙变窄， 肾间质增宽， 有较多淋巴细胞浸润，肾小管内皮细胞坏死、细胞核结构消失等。 M和H 组的肾小球肿胀与肾小囊间隙狭窄程度较L组明显，M 组肾小管内皮细胞坏死、细胞核结构消失较H 组严重，因此，3 个棉酚灌胃组肉仔鸡肾组织受损伤程度为M 组>H 组>L 组。

图7 21 日龄雄性肉仔鸡肾脏病理组织学检查（HE 染色，10×63）

3 讨论

3.1 棉酚对雄性肉仔鸡生长性能的影响

料重比可以反映饲料的质量与饲喂效果。 料重比愈低，饲料的质量与饲喂效果愈好，畜禽生长性能越好。 邹琳等［9］研究表明，棉茬地长期放牧会降低山羊的生产性能。 Zeng 等［12］在肉鸭饲粮中添加含量为152 mg/kg 的棉酚显著降低了平均日增重和平均日采食量。 Mishra 等［13］研究表明肉鸡饲粮中添加15%的棉籽粕显著降低了体重， 提高了料重比，生长性能呈降低趋势。 本试验结果表明，随着灌胃天数的增加，肉仔鸡体内棉酚蓄积，其不仅与蛋白质结合，减少机体对营养成分的吸收，还对消化道造成损伤，影响肉仔鸡的消化功能，进而降低日采食量和增重， 最终导致料重比较大幅度的提高，尤其在16～20 日龄阶段M 组的料重比呈现负增长，进一步表明灌胃150 mg/（kg·BW）剂量的棉酚可以影响肉仔鸡的生长性能， 造成严重的生长抑制，这一结果与Robinson 等［14］的研究结果相似。 同时，本试验结果也表明，M 组的生长抑制效果比L 组和H 组明显，H 组的生长抑制效果较比L 组明显， 而H 组的生长抑制效果不及M 组，这可能与棉酚毒性的累积效应和棉酚摄入的量有关。 一方面因为进入组织的棉酚只有8.9%，细胞的吸收作用具有饱和性， 多余的棉酚经血液输送至肠道、肾脏排出体外［4］；另一方面，棉酚中毒属于慢性中毒，其在体内具有蓄积作用，幼龄动物对棉酚更加敏感［15-18］。

3.2 棉酚对雄性肉仔鸡血清抗氧化能力的影响

机体为了清除过多的氧自由基、过氧化氢、羟自由基，会动用自身的抗自由基活性物质，包括酶系统（GSH-Px、CAT、SOD）和非酶系统（生物抗氧化剂）［19-20］。 GSH-Px 是机体内一种重要的自由基捕获酶，可以保护细胞膜结构及功能的完整性［21］；CAT 是一种酶类清除剂， 能够有效避免羟自由基的过度产生［22-23］。 在正常情况下，机体内自由基的产生与清除保持动态平衡，而CAT 和GSH-Px 活性也维持在正常范围内［24］，使机体抗氧化机能正常运行。当生物体内自由基大量产生，超过了抗氧化物酶所能清除的量时， 自由基通过直接攻击核酸（DNA）、蛋白质、脂质等，导致组织损伤［25］。侯楠楠［26］也通过体外培养原代蛋鸡肝细胞发现棉酚可增加细胞内氧自由基的浓度，造成细胞氧化损伤。线粒体是细胞产生自由基的主要场所， 在正常情况下， 细胞内自由基可作为胞内信号分子参与调控细胞的生长、分化、凋亡和免疫过程［27］。 当组织受到损伤时，线粒体内的自由基水平大增，对线粒体造成损害， 导致线粒体功能甚至细胞各种生命活动异常，进一步使组织受损。Ding 等［28］研究发现接触棉酚会引起小鼠卵母细胞体外成熟过程中线粒体功能障碍，从而诱导氧化应激。

本试验结果显示，5 日龄时3 个棉酚灌胃组的CAT 和GSH-Px 活力高于对照组，11、16 和21日龄时3 个棉酚灌胃组的CAT 和GSH-Px 活力低于对照组， 这可能是因为棉酚在动物体内蓄积到中毒剂量之前有一定的抗氧化作用， 可以使血清中的CAT 和GSH-Px 活力升高，后期随着灌喂天数的增加，棉酚蓄积到一定剂量，其毒性作用使细胞受损，抗氧化酶的产生随之减少，进而使抗氧化能力下降［29-30］，自由基和过氧化物堆积，使机体处于氧化应激状态［31-35］，导致机体抗氧化能力持续下降。 此外，M 组和H 组的CAT 和GSH-Px 活力较L 组低， 而M 组和H 组之间的差别不大，可能是这两组血清中的抗氧化酶活力低， 不能明显反映出二者的差异。

3.3 棉酚对雄性肉仔鸡肾脏的损伤

肾脏是机体主要的排泄器官， 可调节体内钾、钠离子的平衡。 在正常情况下，从肾小球滤出的钾离子大部分通过近曲小管被重新吸收，以保持体内钾的平衡；当体内钾离子过多时，可通过远曲小管排钾吸钠来调节小管内的尿量和尿钾含量［36］。 研究发现棉酚可导致低血钾症等不良反应［37］，棉酚最主要的靶细胞器是线粒体。 余铭清等［38］和苏树芸等［39］研究表明，棉酚可导致肾脏近曲小管的线粒体发生肿胀等异常变化，对肾小管产生损伤作用。 此外，棉酚还可以通过损伤线粒体，干扰与氧化磷酸化有关的其他酶系，进而影响钾离子的主动转运［40］。 在本试验中，与对照组相比，3 个棉酚灌胃组的肾脏细胞均发生了病理学变化：细胞膜溶解、细胞间隙明显变大，肾小囊腔明显缩小甚至消失、结构纹理被破坏，淋巴细胞聚集，肾小管结构不完整等；同时，棉酚在肾脏有一定的蓄积过程，进一步导致肾脏损伤。 本试验得到的结果与祝家东等［10］和王辉等［41］在给予游离棉酚下观察到的小鼠肾脏病理学变化基本一致。此外，肾脏受损程度为M 组>H 组>L 组，表明灌喂150 mg/（kg·BW） 的棉酚对机体造成较大影响。

4 结论

从1 日龄开始给雄性肉仔鸡分别灌服剂量为100、150 和200 mg/（kg·BW）的棉酚，连续灌服20 d，可降低生长性能及血清抗氧化能力，并对肾脏造成损伤； 而随着灌胃时间的延长，以150 mg/（kg·BW）的剂量影响最为明显。