LncRNA SNHG8 通过抑制miR-494-3p 表达减轻脑缺血再灌注损伤

曹天然，刘青芳，潘美民，张雪红

长沙市第一医院1临床试验研究中心，2神经医学中心，湖南 长沙410005

脑卒中是全球范围内导致长期重度残疾和死亡的最常见原因之一［1］。80%～85%的脑卒中病例是由脑缺血引起的，脑缺血通常由大脑大动脉栓塞或血栓栓塞性闭塞所致［2］。介入治疗需要恢复血流，从而导致再灌注损伤。脑缺血再灌注损伤（CIRI）是指随着血流灌注短期恢复，缺血缺氧引起的神经损伤进一步加重的病理过程［3］。越来越多的证据表明，缺血常涉及一系列的神经事件，如缺氧、氧化应激和炎性反应等［4］，最终导致缺血脑的急性坏死、凋亡和自噬［5］。目前，组织型纤溶酶原激活剂是治疗CIRI的唯一有效方法［6］。因此，有必要且迫切地为脑卒中患者寻找新的有效治疗靶点，探讨脑缺血的潜在分子机制。

长链非编码RNA（lncRNA）是一种含有200多个碱基的非编码RNA，可调节基因的转录和翻译、表观遗传机制、细胞分化和其他生理/病理活动［7］。许多研究表明，lncRNA还影响神经系统的许多生理和病理过程，它们已被确定为脑卒中的潜在生物标志物［8］。例如，有证据表明，LncRNA SNHG8表达降低与脑缺血的进展密切相关［9］。LncRNA SNHG8不仅通过调节miR-425-5p保护小胶质细胞免受缺血诱导的炎症反应，而且还缓解了体外和体内脑微血管内皮细胞的损伤［10］。有趣的是，lncRNA 的功能通常是通过调控microRNA 介导的，microRNA通过在转录后与3'UTR结合来调节mRNA表达［11］。例如，LncRNA CASC15 通过直接靶向抑制miR-338-3p的表达，然后促进CIRI的细胞凋亡和炎症反应［12］。因此，我们试图进一步了解LncRNA SNHG8在CIRI中的发生机制。

MicroRNA（miRNA）是一类被广泛研究的内源性RNA，它们不被翻译成蛋白质，但在许多细胞过程中起着至关重要的作用，包括正常的生理和异常病理过程［13］。许多miRNA与脑缺血再灌注损伤有关。例如，已知miR-532-3p下调通过靶向NOX2而加重缺血/再灌注损伤［14］。Zuo等［15］发现miR-652可以通过抑制NOX2而保护缺血/再灌注损伤。此外，据报道，miR-494-3p 通过抑制BHLHE40的表达加剧CIRI后的脑损伤和神经元损伤［16］。然而，LncRNA SNHG8是否能够介导miR-494-3p表达而缓解脑缺血再灌注损伤，目前尚未见到相关报道。

1 材料和方法

1.1 细胞株

人胚肾细胞HEK-293T、小鼠小胶质细胞BV2（武汉普诺赛生命科技有限公司）。

1.2 实验动物

从湖南斯莱克景达实验动物有限公司［SCXK（湘）2019-0004］购买SPF 级的6 周龄雄性C57BL/6J 小鼠（20～25 g）。将所有小鼠饲养在环境控制的房间中，在12小时的光照/黑暗循环下随意获取食物和水。实验方案经长沙市第一医院医学伦理委员会审核批准后实施（2021伦审【临研】第（61）号）。

1.3 主要试剂

胎牛血清、MEM培养基（武汉普诺赛生命科技有限公司）；Lipofectamine 3000TM转染试剂盒、TRIzol试剂、细胞凋亡检测试剂盒（Thermo Fisher Scientific）；异氟醚（上海麦克林生化科技有限公司）；6-0尼龙缝合线（Doccol）；戊巴比妥钠、TTC溶液（Sigma-Aldrich）；4%多聚甲醛、RIPA裂解液（上海碧云天生物技术有限公司）；PrimeScript™RT试剂盒、SYBR®Premix Ex TapTMⅡ试剂盒（TakaRa Bio）；ELISA检测试剂盒IL-1β、IL-6和TNF-α（R&D）；双荧光素酶报告基因检测试剂盒（Abcam）。

1.4 主要仪器

二氧化碳培养箱（深圳市瑞沃德生命科技有限公司）；ABI7500 实时荧光定量PCR 仪（Thermo Fisher Scientific）；酶标仪（Biotek）；流式细胞检测仪（深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司）；高速冷冻型微量台式离心机[大龙兴创实验仪器（北京）股份公司）]。

1.5 细胞培养与处理

HEK-293T细胞和BV2细胞在含有10%胎牛血清和1%青霉素-链霉素溶液的MEM培养基中培养。对于缺氧缺糖/再灌注（OGD/R）细胞模型，将全培养基换成无葡萄糖DMEM，将细胞置于37 ℃厌氧室（95%N2和5%CO2）中2 h，然后重新加入全培养基，保持正常培养状态（37 ℃，5%CO2，饱和湿度）继续培养。48 h后收集细胞用于后续试验。在对照组中，细胞没有被剥夺氧和葡萄糖，正常培养。

1.6 细胞转染

oe-SNHG8、miR-494-3p mimic 及相应对照均购自GenePharma（中国上海）。转染oe-NC或oe-SNHG8后再进行剥夺氧和葡萄糖处理，将细胞分为OGD/R+oe-NC 组或OGD/R+oe-SNHG8 组；将oe-SNHG8 与mimic NC或miR-494-3p mimic共同转染后再进行剥夺氧和葡萄糖处理，将细胞分为OGD/R+oe-SNHG8+mimic NC组和OGD/R+oe-SNHG8+miR-494-3p mimic组。对于转染，根据制造商的说明，将所需质粒与LipofectamineTM3000混合，并转染到指定细胞中。

1.7 小鼠脑缺血再灌注损伤模型建立

通过大脑中动脉闭塞手术建立脑缺血再灌注损伤模型［17］。用异氟醚（4%诱导浓度和2%维持浓度）麻醉小鼠，沿中线切开颈部皮肤，小心地分离左侧颈总动脉、颈内动脉和颈外动脉。接下来，将一根带有圆形尖端的6-0尼龙丝从左侧颈总动脉插入颈内动脉的末端，以阻塞右大脑中动脉的起源。闭塞2 h后，去除尼龙线，让血液通过左侧颈内动脉回流（再灌注），缝合皮肤切口。再灌注24 h后，腹腔注射1%戊巴比妥钠（150 mg/kg）对小鼠实施安乐死，取小鼠大脑组织进行后续实验。术前禁食12 h，自由饮水。术中保留大鼠自主呼吸，维持直肠温36.5～37.5 ℃，术中和术后维持室温25 ℃。Sham组只暴露左侧颈总动脉，不结扎处理，其余均行相同手术操作。

1.8 小鼠神经损伤评估

小鼠神经损伤程度采用神经功能缺失评分和大脑水肿程度确定。小鼠神经功能缺失评分：血液再灌注后24 h，大鼠神经功能缺失通过Longa评分标准确定［18］；大脑水肿程度通过标准的大脑湿重-大脑干质量来确定［19］。大脑提取后迅速称取质量，随后在100 ℃下干燥24 h，称质量。大脑的水肿程度通过公式：（湿质量-干质量）/湿质量×100%。

1.9 TTC染色

将小鼠大脑组织样品在冰箱中于-20 ℃冷冻30 min以进行切片。简而言之，将大脑组织切成2.0 mm厚的冠状切片。并使用2%TTC溶液在37 ℃下对这些切片染色20 min。然后，将切片浸入4%多聚甲醛中固定过夜。然后照相，与正常区域的红色相比，脑损伤区域呈现白色。染色切片用AutoCAD分析软件（San Rafael，CA）成像和分析。

1.10 RT-qPCR检测LncRNA SNHG8和miR-494-3p的表达

按照制造商的说明，使用Trizol试剂从细胞和大脑组织的大脑皮层梗死区域中提取总RNA。使用逆转录试剂盒将总RNA反向转录为cDNA。对浓度和纯度符合要求的RNA 样品，稀释到合适的浓度，利用PrimeScript™RT试剂盒进行逆转录。采用ABI7500实时荧光定量PCR仪，使用SYBR®Premix Ex TapTMⅡ试剂盒，运用Applied Biosystems 7500HT系统进行PCR，并通过2-ΔΔCt方法分析数据。每个样品重复3次，所有反应引物如下表1所示。LncRNA SNHG8用GAPDH为内参，miR-494-3p的相对表达用U6为内参。数据分析采用2-ΔΔCt法，公式如下：ΔΔCt=[Ct（目的基因）-Ct（内参基因）]实验组-[Ct（目的基因）-Ct（内参基因）]对照组。

1.11 流式细胞仪检测细胞凋亡

使用Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒对细胞进行凋亡分析。将各组细胞悬液调整密度为105/mL，每个样品收集1 mL细胞悬液于10 mL离心管中，500 r/min 离心5 min，弃去培养液。PBS 洗涤，500 r/min离心5 min，弃上清。用100 μL的标记溶液重悬细胞，室温下避光孵育10 min。加入5 μL的Annexin V-荧光素异硫氰酸酯（Annexin V-FITC）和5 μL的碘化丙啶（PI），轻轻混匀，室温避光反应10 min。流式细胞仪检测FITC和PI荧光，分析细胞凋亡率。

1.12 ELISA检测细胞中IL-1β、IL-6和TNF-α含量

收集细胞上清和小鼠大脑组织的大脑皮层梗死区域匀浆上清液对炎症因子IL-1β、IL-6 和TNF-α进行ELISA分析。部分脑组织在冰上超声匀浆30 min，将脑组织匀浆和各组细胞4 ℃、12 000 r/min离心10 min，收集其上清液。通过ELISA 试剂盒检测IL-1β、IL-6 和TNF-α含量。所有操作严格按照试剂盒说明书进行。

1.13 荧光素酶报告实验检测LncRNA SNHG8和miR-494-3p的靶向调控关系

根据生物信息学软件Starbase 预测结果，设计LncRNA SNHG8和miR-494-3p结合位点的野生序列和突变序列。通过生工生物工程有限公司合成LncRNA SNHG8野生型Wt-SNHG8和3'UTR结合序列突变型Mut-SNHG8，将野生序列和突变序列片段克隆并分别与pmirGLO 载体结合，将Wt-SNHG8 或Mut-SNHG8 和mimic NC 或miR-494-3p mimic 使 用LipofectamineTM3000共转染到HEK-293T细胞中。转染48 h后，使用双荧光素酶双报告基因试剂盒进行荧光素酶活性检测。

1.14 统计学分析

使用SPSS 23.0进行数据统计学分析，计量资料以均数±标准差表示。所有实验独立重复3次。数据若服从正态分布及各组间满足方差齐性时，采用t检验或单因素方差分析；若数据不服从正态分布，则采用秩和检验进行分析验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 LncRNA SNHG8在脑缺血再灌注损伤小鼠中低表达，而miR-494-3p高表达

Sham组未观察到梗死，I/R组出现明显的梗死区（图1）。神经功能缺失评分结果显示I/R组小鼠神经严重损伤，而且脑水肿程度严重（P＜0.001，图2、3）。ELISA检测结果显示，与Sham组相比，I/R组小鼠脑组织中炎症因子IL-1β、IL-6和TNF-α的表达水平明显增加（P＜0.001，图4）。RT-qPCR 结果显示，I/R 组中LncRNA SNHG8低表达（P＜0.01），而miR-494-3p高表达（P＜0.01，图5）。

图1 Sham组和I/R组小鼠脑组织TTC染色Fig.1 TTC staining of the brain tissue in Sham group and I/R group.

图2 Sham组和I/R组小鼠神经功能缺失评分Fig.2 Score of neurological deficit in Sham group and I/R group.***P＜0.001.

图4 Sham组和I/R组小鼠脑组织中炎症因子IL-1β、IL-6和TNF-α表达水平Fig.4 Expression levels of inflammatory factors IL-1β,IL-6 and TNF-α in the brain tissue of Sham group and I/R group.***P＜0.001.

图5 Sham组和I/R组小鼠脑组织中LncRNASNHG8和miR-494-3p表达Fig.5 Expression of LncRNASNHG8 and miR-494-3p in brain tissue of Sham group and I/R group mice.**P＜0.01.

2.2 过表达LncRNA SNHG8抑制OGD/R模型小胶质细胞的炎症反应

RT-qPCR 结果显示（图6），LncRNA SNHG8 在OGD/R 组中的表达明显降低（P＜0.01），过表达后LncRNA SNHG8的表达明显升高（P＜0.01）。ELISA结果显示，与Control组相比，OGD/R组细胞内炎症因子IL-1β、IL-6和TNF-α的表达水平明显增加（P＜0.01）；与OGD/R+oe-NC组相比，OGD/R+oe-SNHG8组IL-1β、IL-6和TNF-α的含量明显减少（P＜0.01），OGD/R组与OGD/R+oe-NC之间差异性不显著（图7）。

图6 LncRNASNHG8在各组细胞中的表达水平Fig.6 Expression level of LncRNA SNHG8 in microglial cells of each group.**P＜0.01.

图7 各组细胞中炎症因子IL-1β、IL-6和TNF-α表达水平Fig.7 Expression levels of inflammatory factors IL-1β,IL-6 and TNF-α in cells of each group.**P＜0.01.

2.3 过表达LncRNA SNHG8抑制OGD/R模型小胶质细胞的凋亡

流式细胞术检测结果显示（图8），与Control组相比，OGD/R组细胞凋亡率明显增加（P＜0.01）；与OGD/R+oe-NC组相比，OGD/R+oe-SNHG8组细胞凋亡率明显降低（P＜0.01）。OGD/R组与OGD/R+oe-NC之间差异没有统计学意义（P＞0.05）。

图8 各组细胞凋亡率比较Fig.8 Comparison of apoptosis rates among the groups.**P＜0.01.

2.4 LncRNASNHG8靶向负调节miR-494-3p

通过生物信息学网站Starbase 预测了LncRNA SNHG8和miR-494-3p结合的靶位点（图9），并且设计了野生型LncRNA SNHG8（Wt-SNHG8）和突变型LncRNA SNHG8（Mut-SNHG8）。双荧光素酶报告实验结果（图10）显示，与mimic NC 相比，miR-494-3p mimic组明显减弱了Wt-SNHG8的荧光素酶信号（P＜0.01），而对Mut-SNHG8的荧光素酶信号没有显著性差异（P＞0.05）。与OGD/R+oe-NC组比较，转染OGD/R+oe-SNHG8的小胶质细胞中miR-494-3p的表达水平显著降低（P＜0.01，图11）。

图9 生物信息学预测LncRNA SNHG8和miR-494-3p的靶向调控位点Fig.9 Bioinformatic prediction of the targeted regulatory sites of LncRNASNHG8 and miR-494-3p.

图10 双荧光素酶报告实验Fig.10 Luciferase reporter assay.**P＜0.01.

图11 miR-494-3p在两组细胞中的表达水平Fig.11 Expression level of miR-494-3p in two groups of cells.**P＜0.01.

2.5 过表达miR-494-3p逆转了oe-SNHG8对OGD/R模型小胶质细胞炎症反应和凋亡的抑制作用

RT-qPCR检测显示，进一步过表达miR-494-3p的OGD/R模型小胶质细胞中miR-494-3p的水平降低（P＜0.01，图12）。与OGD/R+oe-SNHG8+mimic NC相比较，OGD/R+oe-SNHG8+miR-494-3p mimic炎症因子IL-1β、IL-6和TNF-α的含量增加（P＜0.05，图13），细胞凋亡率增加（P＜0.01，图14）。

图12 miR-494-3p在两组细胞中的表达水平Fig.12 Expression level of miR-494-3p in two groups of cells.**P＜0.01.

图13 两组细胞IL-1β、IL-6和TNF-α含量比较Fig.13 Comparison of the contents of IL-1β,IL-6 and TNF-α between the two groups.*P＜0.05.

图14 两组细胞凋亡率比较Fig.14 Comparison of apoptosis rate between the two groups.**P＜0.01.

3 讨论

缺血性中风是一种常见的神经系统疾病，是全球死亡和长期残疾的主要原因［20,21］。由颅内动脉闭塞或颅外颈动脉闭塞引发的急性缺血性脑卒中约占总脑卒中的85%［22］。在缺血性中风后的几个小时内，神经元会永久受损并经历细胞死亡［23］。因此，拯救受损神经元的治疗选择很重要；然而，迄今为止，只有少数治疗药物被报道可以缓解中风后的神经功能障碍。临床治疗，例如组织纤溶酶原激活剂介导的溶栓，通常受到治疗时间窗口狭窄和长期效果不足的限制［24,25］。在缺血性中风情况下，小胶质细胞发挥着双刃剑的作用，吞噬组织碎片并分泌促炎和抗炎介质，这可能会加剧缺血性损伤或诱导修复［26］。小胶质细胞活化和增殖的损伤已被证明可增加缺血性损伤引起的梗死面积和细胞凋亡［27］。研究发现，MSC-Exos（间充质干细胞来源的外泌体）可以降低OGD/R 诱导的BV-2 细胞凋亡［28］；在OGD/R 模型中，BV2细胞凋亡率升高，儿茶素（100µmol/L）也可以有效地抑制细胞凋亡［29］。在本研究中，我们发现CIRI小鼠动物模型中，LncRNA SNHG8低表达，而miR-494-3p高表达。过表达LncRNA SNHG8可抑制OGD/R模型小胶质细胞的炎症反应和细胞凋亡。LncRNA SNHG8靶向负调控miR-494-3p的表达。过表达miR-494-3p逆转了oe-SNHG8对OGD/R模型小胶质细胞凋亡和炎症反应的抑制作用。从机制上讲，我们的结果表明：LncRNA SNHG8通过抑制miR-494-3p表达，抑制炎症反应和细胞凋亡，从而改善脑缺血再灌注损伤。

近年来，一些lncRNAs 已被证明在CIRI 中失调［30,31］。LncRNA是脑卒中等缺血性损伤后脑血管内皮中新发现的一类调节因子［32］。lncRNA已成为治疗缺血性脑卒中的新靶点［33,34］。例如，抑制LncCHRF通过调节miR-126/SOX6 轴来减少缺血性损伤［35］。敲低LncRNAAK038897可通过调节DAPK1的miR-26a-5靶向来预防脑缺血再灌注损伤［36］。因此，lncRNA作为脑缺血再灌注损伤进展中的新治疗靶点具有巨大的潜力。例如，沉默MALAT1可以抑制OGD-R诱导的细胞凋亡［37］。此外，Zhang等［9］报道lncRNASNHG8通过miR-449c-5p/SIRT1/FoxO1途径抑制小胶质细胞活化和血脑屏障通透性，从而引起对缺血性脑损伤的保护作用。在本研究中，我们通过调节LncRNA SNHG8表达证明了过表达LncRNASNHG8对脑缺血再灌注损伤具有保护作用。

为了识别LncRNA SNHG8的下游靶标，我们通过StarBase生物信息学网站分析发现LncRNA SNHG8与miR-494-3p存在结合位点。MicroRNA（miRNA）是长度约为18～21个核苷酸的短非编码RNA，可以通过靶向其3'非翻译区（3'-UTR）来调节mRNA翻译［38］。超过20%的miRNA在缺血性脑中异常表达，提示miRNA参与缺血性脑卒中的发病机制和发展［39］。miR-424的过表达可以通过抑制小胶质细胞活化来减少缺血性脑损伤［40］。增加miR-224-3p表达可通过降低FAK家族相互作用蛋白（FIP200）的表达来减轻脑缺血/再灌注损伤［41］。miR-494-3p加剧CIRI后的脑损伤和神经元损伤［16］，这与我们的研究结果相似。在本研究中，荧光素酶报告基因检测显示miR-494-3p是CIRI中LncRNA SNHG8的直接靶基因，过表达LncRNA SNHG8抑制miR-494-3p的表达，证明LncRNA SNHG8可以负向调控miR-494-3p的表达。此外，本实验还发现，进一步过表达miR-494-3p，部分逆转了oe-SNHG8对OGD/R模型小胶质炎症反应和细胞凋亡的抑制作用。

总之，LncRNA SNHG8 通过抑制miR-494-3p 表达，抑制炎症反应和细胞凋亡，从而改善脑缺血再灌注损伤。这些结果表明LncRNASNHG8参与脑缺血再灌注损伤的进展，为脑缺血再灌注损伤的治疗提供了一个新的潜在靶点。