沙苑子总黄酮显色条件及提取工艺优选研究
2024-01-12汪小玉税丕先张家伟石厚银沈骅睿
李 婷 汪小玉 税丕先 张家伟 石厚银 沈骅睿
1.西南医科大学药学院，四川泸州 646000；2.西部医药技术转移中心临床研究部，四川成都 610041；3.四川奥邦古得药业有限公司制剂部，四川成都 610000；4.西南医科大学附属中医医院骨伤科，四川泸州 646000
沙苑子为豆科扁茎黄芪（Astragalus complanatusR.Br）的干燥成熟种子[1]，可补肾助阳、固精缩尿、养肝明目，常用于遗精早泄、肾虚腰痛、肝肾不足[2]。其主要成分有多糖、黄酮[3]、酚类[4]、甾醇类[5]等，黄酮类是其主要有效成分。药理研究表明沙苑子总黄酮有抗肿瘤[6]、抗肝损伤[7]、抗炎[8]、抗疲劳、抗衰老[9]、免疫调节[10]等作用。本研究为提高总黄酮提取率，进一步开发利用沙苑子，以芦丁为对照品，筛选NaNO2-Al（NO3）3-NaOH 法和AlCl3法两种黄酮含量测定方法，比较不同脱脂、提取方法对总黄酮含量的影响，并采用单因素结合正交试验的方法优选沙苑子总黄酮的最佳显色条件及提取工艺，以期为其质量控制及后期开发和应用提供理论依据。
1 仪器与材料
1.1 材料与试剂
沙苑子中药饮片（产地：陕西，批号：180201-1）购自泸州百草堂中药饮片有限公司；芦丁（纯度：99.47%，批号：MUST-19010210）购自成都曼斯特生物科技有限公司；其余试剂均为国产分析纯。
1.2 仪器与设备
UV 1700PC 型紫外分光光度计（上海凤凰光学仪器有限公司）；B843662903 型十万分之一天平（上海梅特勒-托利多国际贸易上海有限公司）；JOYN-10A型超声机（上海乔跃电子科技有限公司）；RE20000B型旋转蒸发仪（巩义市予华仪器有限公司）。
2 方法与结果
2.1 样品及标准品溶液配置
沙苑子药材105℃烘干后粉碎，称取过40 目筛的粉末1 g 于圆底烧瓶中，加入80%乙醇30 ml，80℃提取2 h，提取2 次，合并提取液定容至100 ml 备用。精密称取105℃下干燥至恒重的芦丁标品5 mg 于50 ml 容量瓶中以60%乙醇定容，摇匀备用。
2.2 显色方法考察
2.2.1 NaNO2-Al（NO3）3-NaOH 法 分别吸取2 ml 样品和标准品溶液于25 ml 容量瓶中，分别加入0.3 ml 5%NaNO2溶液摇匀并静置6 min、0.3 ml 10% Al（NO3）3溶液摇匀并静置6 min、4 ml 4%的NaOH 溶液，蒸馏水定容，摇匀并静置15 min。
2.2.2 AlCl3法 分别吸取样品和标准品溶液0.8 ml于10 ml 容量瓶中，加入60%乙醇1.2 ml、2% AlCl3溶液0.8 ml、1 mol/L 醋酸-醋酸钠缓冲液1.2 ml，60%乙醇定容，摇匀，室温下放置30 min。
紫外全波长扫描结果见图1 ～2，NaNO2-Al（NO3）3-NaOH 法仅芦丁标准品在510 nm 处有最大吸收峰，样品溶液无相同最大吸收峰；AlCl3法芦丁标准品和样品溶液在420 nm 处均有最大吸收峰。因此沙苑子总黄酮含量测定应采用AlCl3法。
图1 NaNO2-Al（NO3）3-NaOH 法
2.3 显色条件的优化
2.3.1 单因素考察 分别吸取样品溶液0.8 ml，考察AlCl3溶液用量（0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 ml），AlCl3溶液浓度（1%、2%、3%、4%），显色时间（10、20、30、40 min），醋酸-醋酸钠缓冲液pH 值（3.6、4.5、5.4、7.0），醋酸-醋酸钠缓冲液用量（0.4、0.8、1.2、1.6、2.0 ml）对总黄酮含量的影响。结果见图3 ～7。
图4 AlCl3 浓度的影响
图5 时间的影响
图6 醋酸-醋酸钠缓冲液pH 值的影响
图7 醋酸-醋酸钠缓冲液用量的影响
2.3.2 显色条件正交试验 选择AlCl3用量（A）、AlCl3浓度（B）、显色时间（C）、缓冲液用量（D）建立4因素3水平表，见表1。试验结果及极差分析见表2。结果显示，影响总黄酮含量的主次因素为D＞A＞B＞C，最佳显色条件为A1B1C1D3，即2% AlCl30.6 ml，pH 4.5的缓冲液2.0 ml，室温显色20 min。3 次重复性实验结果显示吸光度平均值为0.934 L/（g·cm），RSD为1.16%，重复性良好。
表1 正交试验因素水平
表2 正交试验
2.4 标准曲线的绘制
精密吸取芦丁溶液0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.6 ml于6 个10 ml 容量瓶中。以AlCl3法最优条件显色，于420 nm 处测定吸光度。以芦丁浓度和吸光度为横、纵坐标，绘制标准曲线，线性回归方程为：A=2.0586C+0.01（r=0.9996）。结果表明，芦丁在40 ～160 μg/ml 范围内线性关系良好。
2.5 提取方法考察
分别称取石油醚脱脂后药材粉末1 g 于3 个100 ml 圆底烧瓶，加入80% 乙醇20 ml（料液比1 ∶20）分别超声提取、80℃温浸、80℃回流提取1.5 h，抽滤，滤液备用。将3 种提取液分别显色后，于420 nm 处测吸光度。结果见表3，其中以回流提取法提取沙苑子总黄酮最佳。
表3 沙苑子总黄酮的含量
2.6 提取条件的优化
2.6.1 提取单因素考察 准确称取1 g 药材粉末，考察不同乙醇浓度（50%、60%、70%、80%、90%），提取温度（50、60、70、80、90℃），提取时间（0.5、1、1.5、2、2.5、3 h），料液比（10、15、20、25、30、35、40 g/ml），提取次数（1、2、3 次）对提取效率的影响。因素水平结果见表4。
表4 提取条件因素水平
2.6.2 提取工艺正交试验 根据预实验结果，以及各因素所取水平范围，选定L9（34）正交表，对乙醇浓度（A），提取温度（B），提取时间（C），料液比（D）4 个因素进行考察。正交试验及方差分析见表5 ～6。结果表明，影响沙苑子总黄酮提取的4 个因素均有统计学意义，主次因素为C＞D＞B＞A，最佳提取条件为A1B3C3D1，即70%乙醇，85℃提取2 h，料液比1 ∶25（g/ml），提取2 次。
表5 提取条件正交试验
表6 方差分析
2.7 验证性实验
为验证最佳提取工艺的稳定性，进行3 次重复性实验，见表7。结果显示沙苑子平均总黄酮含量为24.50 mg/g，RSD＜2%，可知沙苑子总黄酮提取最佳工艺的重复性良好，该提取工艺合理且可行。
表7 验证性试验结果
3 讨论
本实验采用紫外-可见分光光度法，以单因素结合正交试验法，考察了显色及提取工艺对沙苑子总黄酮含量的影响。结果表明，AlCl3法适用于其含量测定，最佳显色条件为0.8 ml 提取液加入1.2 ml 60% 乙醇，2% AlCl3溶液0.6 ml、pH 4.5 的醋酸-醋酸钠缓冲液2 ml，60%乙醇定容至刻度，室温静置20 min。以回流提取法提取效果最佳，最佳工艺为70%乙醇85℃回流提取2 次，每次2 h，料液比1 ∶25（g/ml）。重复性较好，平均总黄酮含量RSD=1.87%，沙苑子总黄酮含量为24.50 mg/g。
目前黄酮的测定方法主要有比色法[11]、HPLC法[12]、薄层色谱法[13]等。NaNO2-Al（NO3）3-NaOH法中，黄酮类物质先被NaNO2还原，再与Al（NO3）3生成螯合物，NaOH 使黄酮开环，溶液变为红橙色[14]。芦丁中有邻二酚，3-、5-OH，AlCl3可与之螯合，形成稳定的络合物，表现为黄色的颜色反应，在410 nm 左右有最大吸收[15]。经检测，沙苑子黄酮与AlCl3反应在420 nm 处有最大吸收，可能与其黄酮中含有邻二酚、3-和5-OH 等基团有关。紫外-可见分光光度法测定总黄酮含量具有操作简单、测定快速、对仪器要求不高等优点。本研究方法操作简便、可行性高，为沙苑子的进一步开发研究提供了实验基础。
