分子突变类型检测在甲状腺结节诊断中的应用

冯石坚 冯丽萍 陈贵俦 梁宏伟 敖智宪 杨立业 黄世勇

广东省阳江市人民医院普外科，广东阳江 529500

甲状腺癌已被列入最常见恶性肿瘤，成为发病率增长较快的实体肿瘤之一[1]。大多数的甲状腺结节属于良性结节，恶性处于少数[2]。目前，临床常采用细针穿刺活检（fine needle aspiration，FNA）评估甲状腺结节性质，但由于穿刺部位、采集方法和检测技术的限制易导致FNA 出现部分漏诊或误诊的情况[3]。随着分子生物技术的发展，结合甲状腺癌的分子标志物，分子诊断技术在甲状腺结节临床诊断中得到了应用和发展[4-5]。本研究从甲状腺癌与相关基因的关联性展开研究，以期为甲状腺癌进行早期诊断、风险分层及个体化治疗方案的制订作出指导，达到临床效益的最大化。现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2019 年10 月至2021 年10 月阳江市人民医院收治的1600 例甲状腺结节患者为研究对象，男598 例，女1002 例，年龄21 ～75 岁，平均（45.88±7.76）岁。纳入标准：①术前影像学诊断为甲状腺结节者；②同意进行甲状腺结节细针穿刺术检查者；③无甲状腺结节穿刺术禁忌证者；④对本研究知情同意者。排除标准：①依从性较低者；②具有不明原因的出血病史或出血倾向者；③超声引导下仍不能确定活检部位者；④甲状腺或肿瘤组织血流异常丰富者；⑤严重心、肝、肺、肾功能不全者。本研究经医院医学伦理委员会批准（阳人医伦理【20210151】号）。

1.2 方法

所有患者均行细针穿刺术检查，采用CL 型22 ～27 G 穿刺针（日本八光商事株式会社），操作如下：①取患者仰卧位，暴露颈前区；常规消毒、铺巾，超声探查甲状腺，用2%利多卡因（上海朝晖药业，国药准字H31021072，规格：5 ml×5 支/盒）由皮肤至甲状腺进行局部麻醉；②操作者一只手固定超声探头，另一只手持22 ～27 G 穿刺针沿着扫描平面斜行插入，并实时观察入针情况；③当针尖到达结节中心时停止进针，在不同针道于5 s 内来回提插4 ～5 次（迅速退针，用纱布压迫进针点，同样体位、方法，但采用不同穿刺角度穿刺结节，一般不超过4 针；④穿刺结束后，以创可贴保护穿刺点，用手按压15 min，观察情况，如为甲状腺囊性病变，则将穿刺针置结节中央固定，缓慢抽吸，吸尽囊液送病理检查。

将穿刺标本分别保存于细胞保存液和基因检测溶液中，分别送细胞学病理检查和分子诊断技术检测，后者主要包括BRAF 基因点突变、RAS 基因突变，RET/PTC 基因突变的检测，其中BRAFV600E基因检测采用Real-time Quantitative PCR 方法，仪器为7500 型号PCR 仪（美国应用生物系统公司）；TRET、RET、RAS 基因检测采用高通量测序技术，仪器为Ilumina next seq 550/500 型号高通量测序仪（Ilumina 公司），并分别得出结果。

对于未行手术治疗良性患者随访12 个月，证实甲状腺结节至少2 个切面的径线增大＜20%、径线增长＜2 mm、结节体积增大＜50%、未新出现可疑恶性超声征象，以上4 个征象均符合者判定结果为良性[6]。对术前穿刺病理、分子技术诊断提示有手术指征的恶性或良性患者行规范化手术治疗，进行术后病理检查和随访；以术后病理结果为最终诊断标准，术前穿刺活检结果良性包括贝塞斯达（Bethesda）Ⅰ～Ⅳ类，即不能诊断或不满意（标本中的滤泡上皮细胞数量过少，甚至缺乏，无结果）、良性，意义不明确的非典型病变或滤泡样病变、滤泡样肿瘤或可疑滤泡样肿瘤。将术前FNA 结果可疑恶性和恶性均判定为穿刺结果恶性。其中，A=真阳性；B=假阳性；C=假阴性；D=真阴性；阳性预测值=A/（A+B）；阴性预测值=D/（C+D）；敏感度=A/（A+C）；特异度=D/（B+D）；准确度＝（A+D）/（A+B+C+D）。

1.3 统计学方法

选择SPSS 23.0 统计学软件进行数据分析，计量资料以均数±标准差（）表示，采用t检验，计数资料以[n（%）]表示，采用χ2检验，P＜ 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 甲状腺结节术前FNA检查与术后病理结果比较

1600 例患者中符合手术指征并给予手术治疗的有968 例，均于术后进行病理检查，FNA 检查良性病灶检出1255 例，检出率为78.44%（1255/1600）。以术后病理为标准对这968 例患者展开研究，结果显示，FNA 检查对甲状腺结节的敏感度、特异度、准确度分别为84.38%、89.92%、88.01%，阳性预测值和阴性预测值分别为81.45%、91.65%。甲状腺结节术前FNA 检查（345 例）与术后病理结果（333 例）检出率比较，差异无统计学意义（χ2=0.326，P=0.567），见表1。

表1 两种方式诊断情况比较

2.2 术前分子诊断技术与术前FNA检查、术后病理结果比较

对968 例甲状腺结节患者的FNA 样本实施基因检测，其中有352 例发生了基因突变，占36.36%。以术后病理结果为标准，分子技术诊断的敏感度、特异度、准确度、阳性预测值、阴性预测值分别为84.98%、89.13%、87.71%、80.40% 和91.88%。术前分子诊断技术（80.40%）与术前FNA 检查（81.45%）准确率比较，差异无统计学意义（χ2=0.109，P=0.740），见表2。分子诊断基因中以单一BRAFV600E突变最为常见，占73.86%，见表3。

表2 术前分子诊断技术与术后病理结果比较[n（%）]

表3 术前分子诊断技术结果

2.3 术前FNA检查联合分子诊断与术后病理结果比较

对行手术治疗的986 例患者，将FNA 检查阳性或分子诊断阳性认定为FNA 检查联合分子诊断阳性，FNA 检查和分子诊断同时为阴性时认定为FNA 检查联合分子诊断阴性。FNA 联合分子诊断敏感度、特异度、准确度、阳性预测值、阴性预测值分别为96.99%、95.43%、95.97%、91.76%和98.38%。FNA 检查联合分子诊断结果在甲状腺良恶性结节的差异有统计学意义（P＜ 0.05），见表4。术前FNA检查与穿刺检查联合分子诊断结果差异有统计学意义（P＜ 0.05），见表5。

表4 FNA检查联合分子诊断与术后病理结果比较

表5 术前FNA检查与FNA检查联合分子诊断结果比较

2.4 随访情况

所有手术患者根据情况分别行甲状腺大部分切除术、甲状腺单叶全切或双叶全切、甲状腺癌根治术或扩大根治术手术。本研究其余632 例甲状腺结节患者经FNA 联合分子诊断为良性，无手术指征，进行为期12 个月随访，均为良性。

3 讨论

有研究报道，自1989 年起，甲状腺癌发病率在美国增长了近5 倍，成为威胁美国女性身体健康生命安全的恶性肿瘤之一[6]。甲状腺结节在人体异常生长，如治疗不及时，颈部受到压迫，影响患者生活，恶性甲状腺癌也会严重威胁患者生命安全[7]。

FNA 作为一种微创检查手段，相对可靠经济，有助于提升甲状腺结节良恶性检测的准确率，为甲状腺结节患者的治疗提供针对性方案，避免不必要的手术[8]。根据遗传学分析研究，对于甲状腺肿瘤中滤泡型甲状腺癌，其诊断依据主要是血管或包膜的侵犯，因此不适宜采用术前FNA 检查，分子基因突变诊断技术成为鉴别甲状腺结节性质的有效补充[9]。

本研究结果显示术前FNA 检查恶性病灶检出345 例，其中术后组织学病理恶性281 例，良性64例。甲状腺结节术前FNA 检查与术后病理结果比较，差异无统计学意义（P＞ 0.05），研究结果提示术前穿刺检查结果诊断准确率较高，但仍有15%左右的误诊或漏诊情况。有研究提出，临床可通过重复进行FNA 或许有助于恶性风险相对较低甲状腺结节进一步诊断[10]。但本研究认为FNA 是一种有创性检查手段，反复操作会对患者造成检查副伤害，患者不易接受，不便于反复操作；且术前FNA 检查与穿刺部位、患者甲状腺结节性状以及医生操作手法、诊断经验都有密切关系，FNA 检查仍不能完全取代术后病理诊断[11]。

本研究结果显示，968 例甲状腺结节患者有352 例发生基因突变，基因突变率为36.36%，其中基因突变中以单一BRAFV600E最为常见，占比高达73.86%。未发生基因突变的甲状腺结节有616 例，占63.64%；深入观察结果发现所有恶性结节中有283 例发生基因突变，占比高达80.40%（283/352）。研究认为若临床分子检测能够改变预期手术决策，术前应考虑进行BRAFV600E突变或突变谱检测；当临床出现重复术前FNA 和/或分子检测无法进行的情况，或其结果仍不明确，可再决定随访观察或诊断性外科手术[12]。为了进一步研究基因突变诊断价值，本研究对于BRAFV600E突变患者结合术前FNA 结果给予积极的相应治疗手段，通过跟踪随访发现，这类患者的复发率大大减少，远低于目前临床有关研究BRAFV600E突变复发率高达20%的数据。因此，本研究认为BRAF 单基因检测作为临床病理学预测因子，对指导甲状腺癌诊疗具有重要意义。

合并有1 个以上的已知致癌基因突变更有利于评估高复发风险等甲状腺侵袭性生物学行为，这将有望作为预测不良预后更具特异性的标志物。本研究结果可见FNA 检查联合分子基因突变诊断的敏感度为96.99%，特异度95.43%，准确率为95.97%，阳性预测值91.76%，阴性预测值98.38%，相较于单一检测诊断准确度进一步提升。因此，本研究认为分子基因突变可见多个致癌基因突变并存时，可考虑甲状腺乳头状癌侵袭性及复发风险显著增加情况；运用特定基因的突变状态有助于探讨甲状腺癌的发病机制，有助于进一步识别甲状腺肿瘤的临床表型，联合术前穿刺检查，为甲状腺结节病理类型及预后提供指导[13-15]。

本研究具有一定的创新性，根据现有研究趋势结合医院实际，将甲状腺癌的新兴生物标志物和治疗靶标与术前FNA、术后随访相结合，综合对比分析术前FNA 病理，为甲状腺肿瘤危险分级提供更客观参考依据；但本研究也有一定的局限性，单纯分子基因突变检测尚无法明确地诊断或排除术前FNA 诊断为不能诊断或不确定性质的结节的恶性可能；且本研究对于未经病理诊断患者，因分子诊断结果为良性而未采取手术，可能会出现误诊情况，且纳入病例均为自愿接受分子基因检测的患者，对于因费用问题具有一定的偏颇性，因此需要多中心、大样本、长期的前瞻性研究，更加客观地评价分子基因突变诊断的价值。

综上所述，分子突变类型检测技术有助于提高甲状腺结节临床诊断准确性，联合术前穿刺检查能为甲状腺癌患者的个体化精准医疗提供依据。