二甲双胍通过AMPK/Sirt1信号通路延缓心肌细胞衰老

余 星 刘文炽 肖婧雯 张 彦

1.福建医科大学附属福州市第一医院心内科，福建福州 350004；2.福建医科大学附属第一医院创伤外科，福建福州 350004

衰老是生物体结构和功能随着年龄的增长而下降的一种自然过程，心脏重量随着年龄的增长而增加，而心肌细胞数量逐渐减少，这种功能性心脏细胞的持续丧失伴随着再生活动的下降[1]。心肌细胞的衰老伴随着心肌收缩力降低，自噬功能及抗应激能力不断下降，最终引起心功能障碍[2-3]。近年来，延缓心肌细胞衰老作为预防心血管疾病的潜在靶点受到广泛关注。二甲双胍是治疗2 型糖尿病的一线首选药物[4]，其除了具有降糖作用外，在干预衰老的几个关键通路中具有独特的地位[5]，使用二甲双胍可降低衰老相关疾病（包括癌症和心血管疾病）的全因病死率[6]。Xia 等[7]发现二甲双胍可以通过抑制内皮细胞衰老，从而缓解5-氟尿嘧啶诱导的小鼠肠道损伤。AMP 活化蛋白激酶[adenosine 5’-monophosphate （AMP）-activated protein kinase，AMPK]是许多细胞途径的关键调节因子，在防治衰老方面起着至关重要的作用。二甲双胍可激活心肌细胞、肝细胞和骨骼肌细胞的AMPK，从而保护心血管。沉默信息调节剂2 相关酶1（sirtuin1，Sirt1）是一种NAD+依赖性脱乙酰酶，参与细胞周期调控、炎症、自噬和衰老等大量生物过程，在预防人类各种疾病方面发挥着重大作用。但目前有关二甲双胍是否对衰老心肌细胞具有保护作用及AMPK/Sirt1 在其中发挥的作用并无确切研究。本研究通过观察潜在抗衰老药物二甲双胍对百草枯诱导的小鼠心肌细胞衰老的影响以及AMPK/Sirt1 信号通路在其中的作用，探讨二甲双胍的心脏保护作用，以期为心脏衰老的防治提供新的治疗思路。

1 材料与方法

1.1 实验材料

HL-1 心肌细胞系（武汉普诺赛科技公司）；二甲双胍、β-半乳糖苷酶活性检测试剂盒（北京索莱宝科技公司）；百草枯（阿拉丁公司）；活性氧检测试剂盒（江苏碧云天生物公司）；β-actin 抗体、Anti-AMPK 抗体、Anti-Sirt1 抗体（abcam 公司）。超净工作台（北京亚泰科隆仪器技术有限公司）；流式细胞仪（BD 公司）；电热恒温培养箱（上海精宏实验设备有限公司）；电泳槽（美国BioRad 公司）；化学发光仪（美国Thermo 公司）。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 HL-1 心肌细胞，培养条件为DMEM+10%FBS+1%P/S，置于5%CO2，37℃的培养箱中培养。

1.2.2 心肌细胞衰老模型的建立 心肌细胞在6孔板内生长至合适密度时，加入100 μmol/L 的百草枯（paraquat，PQ）培养72 h[8]。通过衰老相关β-半乳糖苷酶染色（senescence associated β-galactosidase，SA-β-Gal）[8]、活性氧（reactive oxygen species，ROS）活性[8]鉴定模型是否成功。

1.2.3 细胞分组与处理 细胞分组如下，①空白对照组（CK 组）：不做特殊处理；②百草枯组（PQ组）：心肌细胞暴露于100 μmol/L 的PQ；③二甲双胍（metformin，MET）干预组（PQ+0.01/0.1/1/10 mM MET 组）：心肌细胞暴露于100 μmol/L 的PQ 中60 min，用含不同浓度的二甲双胍（0.01、0.1、1、10 mmol/L）的培养处理10 d；④二甲双胍联合AMPK siRNA 干预组（PQ+0.1 mM MET+si-AMPK组）：HL-1 心肌细胞加用AMPK siRNA 处理1 h，于100 μmol/L 的PQ 中干预1 h，再用二甲双胍0.1 mmol/L 处理10 d；⑤AMPK 沉默组（si-AMPK组）：构建AMPK 沉默载体（AMPK siRNA）并转染心肌细胞；⑥转染试剂对照组（mock 组）：用空载转染心肌细胞；⑦阴性序列对照组（NC 组）：阴性对照转染心肌细胞。

1.2.4 SA-β-Gal 细胞种于6 孔板中，用PBS 洗涤后加入1 ml 的SA-β-Gal 染色固定液，将固定液弃去后用PBS 清洗，同时在每孔中再加入1 ml 的SA-β-Gal 染色工作液，封口膜封住6 孔板，将培养板放置于恒温箱中孵育过夜。染色结束之后于普通光学显微镜下观察，并计算细胞衰老率。

1.2.5 ROS 水平检测 根据试剂说明，本研究采用流式法测定细胞内ROS 水平，并按照之前的实验方法来操作[8]。

1.2.6 蛋白质印迹法（Western blot，WB） 处理后的细胞用RIPA 缓冲液充分裂解，4℃12 000 g 离心15 min 得到总蛋白，使用BCA 蛋白质测定试剂盒定量蛋白质浓度，电泳后转移到PVDF 膜上，使用5% 脱脂牛奶封闭1 h，封闭完后将膜放入装有一抗的抗体杂交盒中，4℃孵育过夜。TBST 洗膜后加入二抗，室温孵育2 h，TBST 洗膜后，加ECL 试剂进行显色、曝光，并使用Image J 软件进行定量。

1.2.7 RNA 干扰 AMPK siRNA 序列：正义链为5’-GCAGAAGUAUGUAGAGCAATT-3’，反义链为5’-T T G C T C T A C A T A C T T C T G C T T-3’，阴性对照（negative control，NC）序列：正义链为5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3’，反义链为5’-ACGTGACACGTTCGGAGAATT-3’，RNA 干扰参照既往方法进行[8]。

1.3 统计学方法

使用GraphPad Prism 7.0 软件分析结果并绘制统计图，计量资料用均数±标准差（）表示，两组间比较采用t检验，三组及以上比较采用单因素方差分析，P＜ 0.05 为差异有统计学意义，P＜ 0.01为差异有显著统计学意义。

2 结果

2.1 二甲双胍减轻百草枯诱导的心肌细胞衰老及最适浓度筛选

与CK 组比较，100 μmol/L 百草枯干预心肌细胞72 h 后能增加细胞衰老率及ROS 水平，不同浓度二甲双胍均可降低百草枯诱导的心肌细胞衰老率（图1A）及ROS（图1B），以0.1 mmol/L 浓度时差异最为显著，差异有显著统计学意义（P＜ 0.01），因此选择0.1 mmol/L 作为二甲双胍的最适浓度用于后续实验。

图1 二甲双胍对心肌细胞衰老的影响及最适浓度筛选

2.2 二甲双胍对AMPK、Sirt1蛋白表达的影响

WB 检测发现PQ 诱导的心肌细胞内AMPK、Sirt1 蛋白表达下降，而经过二甲双胍预处理能够部分逆转AMPK 和Sirt1 蛋白表达的下降，差异有显著统计学意义（P＜ 0.01），见图2。

图2 二甲双胍对AMPK、Sirt1 蛋白表达的影响

2.3 AMPK siRNA对AMPK、Sirt1蛋白表达的影响

与转染试剂对照组（mock 组）比较，阴性序列对照组（NC 组）AMPK、Sirt1 表达水平的差异无统计学意义（P＞ 0.05）。而与NC 组比较，AMPK 沉默组（si-AMPK）AMPK 蛋白表达明显减少，同时Sirt1 表达也显著减少，差异有显著统计学意义（P＜ 0.01），见图3。

图3 AMPK siRNA 对AMPK、Sirt1 蛋白表达的影响

2.4 AMPK siRNA显著抵消二甲双胍改善心肌细胞衰老作用

PQ+0.1 mM MET+si-AMPK 组Sirt1 蛋白表达较二甲双胍干预组明显降低（图4）；且细胞衰老阳性细胞比例（图5A）及ROS 活性（图5B）较二甲双胍干预组显著升高，差异有统计学意义（P＜ 0.05），但与PQ 组比较差异无统计学意义（P＞ 0.05）。见图5。

图4 AMPK siRNA 显著抵消二甲双胍改善心肌细胞衰老作用

图5 抑制AMPK 表达和二甲双胍处理对细胞衰老的影响

3 讨论

本研究结果显示，百草枯能成功诱导小鼠心肌细胞衰老，而不同浓度二甲双胍通过调控AMPK/Sirt1 信号通路很大程度上延缓百草枯诱导的细胞衰老。

构建细胞衰老模型的方法较多，有自然衰老模型、D-半乳糖、过氧化氢及肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）诱导模型等，其中百草枯诱导衰老模型[8]容易操作，结果较稳定。故本研究采用百草枯干预心肌细胞，结果发现细胞衰老阳性比例和ROS 水平增加，这与公认的细胞衰老特征一致，表明心肌细胞衰老模型构建成功。研究发现二甲双胍具有独立于降糖作用外的抗细胞衰老作用，二甲双胍可通过抑制胰岛素样生长因子（insulinlike growth factors -1，IGF-1）介导的磷酸酰肌醇3 激酶/蛋白激酶B 信号通路来延缓2BS 细胞衰老[9]；同时，二甲双胍通过蛋白磷酸酶2/蛋白激酶B 通路诱导结直肠癌细胞衰老，从而抑制结直肠癌细胞增殖[10]，为肿瘤的治疗提供了一定思路；本研究也发现二甲双胍能明显降低心肌细胞衰老率及ROS 水平，提示二甲双胍能抵抗小鼠心肌细胞衰老。

AMPK 的激活可减少与衰老相关的SA-β-Gal 细胞阳性率，恢复血管平滑肌细胞的增殖，是防治衰老的一个潜在靶标。二甲双胍通过磷酸化催化α 亚基上的关键调节位点来诱导AMPK 活化，抑制核因子κB 信号传导并减轻细胞炎症[11]。同时二甲双胍抑制IGF-1 信号传导，导致胰岛素水平降低，这些共同抑制炎症和自噬，有利于拮抗衰老过程[12]。Sirt1 是一种NAD+依赖性脱乙酰酶，能抵抗氧化应激、炎症和心血管衰老。研究表明，Sirt1的表达随着小鼠年龄的增长而减少，当过表达Sirt1时，心肌肥大、氧化应激等相关衰老标志物下降[13]；当Sirt1 缺乏时，p53 乙酰化积累增多，从而增强氧化应激诱导的细胞衰老[14]。研究指出，AMPK 依赖细胞内NAD+水平升高而激活Sirt1，二者相互调节，共享许多靶分子[15]。本研究发现百草枯在诱导HL-1 心肌细胞衰老过程中，AMPK 和Sirt1 表达水平显著下降；经二甲双胍处理后，AMPK 和Sirt1 蛋白的表达上调；值得注意的是，在AMPK 抑制后，二甲双胍的有益作用不再可见。

综上所述，本研究提示在百草枯诱导的HL-1心肌细胞衰老模型中，二甲双胍可能通过上调AMPK、增加Sirt1 表达而延缓衰老。但本研究为体外实验，尚不能准确反映在体内的情况，有待后续进一步的动物实验来深入研究。