云南红河彝族人群CYP2C9和VKORC1基因突变频率与华法林维持剂量的关系*

娄云丽,熊 浩,欧海波,钱孟佼,刘 旭

(1.云南省滇南中心医院/红河州第一人民医院 a.病案统计科 b.心胸外科,云南 蒙自 661100;2.青岛大学附属医院/青岛大学附属心血管病医院心脏外科,山东 青岛 266000)

华法林是心脏瓣膜置换术后的主要抗凝药物,但治疗剂量因种族和个体间的不同,差异较大[1],细胞色素P450 2C9基因(Cytochrome P450 2C9,CYP2C9)和维生素K环氧化物还原酶复合1基因(Vitamin K epoxide reductase complex 1 gene,VKORC1)所编码的蛋白酶是主要的华法林代谢酶[2]。除CYP2C9*1野生型外,CYP2C9*2(C.430C>T)、CYP2C9*3(C.1075A>C)位点突变可导致CYP2C9酶的代谢活性减低[3];同时,VKORC1基因-1639 G>A位点突变的单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)可解释5%～28%的不同人群中华法林维持剂量的差异情况[4]。云南红河地区彝族人口众多,呈大杂居、小聚居的特点,少数民族间通婚和表亲婚姻的现象较为常见,导致其基因型与内地汉族有较大差异[5,6]。本研究旨在探明红河彝族CYP2C9、VKORC1基因突变频率与华法林维持剂量的关系,为华法林的个体化给药研究提供理论支持,现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

收集2018年10月-2021年10月在红河州第一人民医院就诊的红河州彝族心脏人工瓣膜置换术后的140例患者进行临床资料匹配,数据纳入实验组,同时纳入汉族人群作为对照组:共172例。收集外周血标本、收集临床相关因素如:年龄、性别、体重、身高、国际标准化比值(international normalized ratio,INR)等相关临床资料及华法林实际维持剂量(Acture Warfarin Dose,AWD),见表1。本研究所收集数据已经医院伦理委员会批准。

表1 入组人群一般临床资料

纳入标准:(1)心脏瓣膜置换术后接受华法林抗凝治疗;(2)华法林抗凝状态平稳;(3)INR在1.5～3.0之间。排除标准:(1)患有血液系统疾病、出血性疾病或恶性肿瘤;(2)患有胃肠道活动性溃疡或在近3个月内发生过消化道出血;(3)妊娠期和哺乳期妇女;(4)严重肝功能不全和肾功能不全患者;(5)华法林过敏;(6)患者依从性差,不配合完成随访者。

1.2 研究方法

实时荧光定量PCR反应体系检测CYP2C9和VKORC1基因的多态性,根据反应曲线及△Ct值来确定样本DNA的基因型。比较入组患者CYP2C9等位基因的突变位点(CYP2C9*1、CYP2C9*2、CYP2C9*3)和VKORC1-1639G>A基因多态性的分布差异。本研究中,根据数据的正态性及方差齐性,对计数资料的检验采用了泊松检验,对计量资料分组检验采用了卡方检验、秩和比检验等方法,以上统计分析过程由Stata 16软件完成。

2 结果

2.1 收集患者相应临床资料,见表1。

2.2 所有入组患者行实时荧光定量PCR反应检测

检测CYP2C9和VKORC1-1639G>A的基因分型,见图1。

图1 患者CYP2C9和VKORC1-1639G>A基因分型PCR扩增反应曲线

2.3 分析遗传基础信息

红河彝族居民体表面积(Body Surface Area,BSA)均值为:1.56±0.16m2,较汉族人群偏低(P<0.001)。红河州彝族居民 INR均值为:1.86±0.92,低于汉族人群的2.33±0.40(P<0.001);红河州彝族居民高血压与心脏病患病率均低于汉族人群(P<0.001);彝族人群NYHA3级低于汉族人群,而NYHA4级要比汉族人群偏高;华法林实际剂量2组人群无明显差异,见表2。

表2 2组组人群遗传基础信息及INR值的比较

2.4 分析2组人群中CYP2C9突变位点和VKORC1-1639 G>A基因分型的分布差异

CYP2C9*1/*1及VKORC1-1639 AA的基因分型为研究人群中的主要构成;但汉族人群中的VKORC1-1639 AA纯合突变率要高于红河彝族人群中(P<0.001),见表3。

表3 CYP2C9突变位点和VKORC1-1639G>A基因分型在2组人群中的分布差异

2.5 进一步分析不同的CYP2C9突变位点和VKORC1-1639 G>A基因分型是否会对不同人群的AWD值产生差异影响

结合上述基因分型特点,构建患者AWD值的分布箱式图,见图2;CYP2C9*3位点突变包括:*1/*3突变杂合和*3/*3突变纯合,由于突变频率低,合并为CYP2C9*3(*1/*3、*3/*3)+VKORC1 AA基因分型,其AWD值总体分布在1.75～2.50mg/d(中位数);而对于CYP2C9*1/*1+VKORC1 AA的主要基因分型,2组人群AWD值总体分布在2.0～3.0mg/d(中位数);CYP2C9*1/*1+VKORC1 GA基因分型,2组人群AWD值总体分布在3.0～4.0mg/d(中位数),见图2。方差分析发现:不同基因分型,2组人群中AWD值的分布并无统计学差异,见表4。

图2 AWD值分布情况箱式图

表4 2组人群中不同CYP2C9+VKORC1-1639 AA基因分型中华法林AWD均值比较

3 讨论

3.1 不同民族华法林相关代谢基因的突变情况

华法林抗凝的靶点是竞争性抑制VKORC1亚基,而VKORC1-1639 G>A的突变,可导致VKORC1表达减少,从而使维生素K的循环利用减少,维生素K依赖性凝血因子Ⅱ、Ⅶ、Ⅸ、Ⅹ活性降低,使华法林抗凝剂量的需要量明显减少[3];同时,CYP2C9*2、*3的突变,可导致细胞色素CYP2C9酶转录后在肝脏中的代谢活性分别降低30%、80%[7],使患者所需华法林AWD值减少。有文献报道:白种人群CYP2C9*2(C.430C>T)突变率为22%[8],亚洲人群里,中国及东亚人群并没有发现CYP2C9*2突变等位基因或突变频率极低[9-11],而南亚印度多个地区CYP2C9*2的突变频率波动较大,在1.2%～9.6%左右[12],CYP2C9*5、*6、*8 和 *11常见于非洲人群[13,14];VKORC1 1639G>A突变频率在白种人群中为65%～75%左右,中国人群中为99%,而南亚印度的突变频率却明显要低得多,且南北地区的波动幅度在11.7%～31%左右,可能与印度国内种族较多有关联[12]。因此,由于地域、人种等的不同,CYP2C9及VKORC1 1639G>A突变频率差异较大,是导致华法林抗凝剂量差异大的原因之一[15]。

本文仅在汉族人群中发现1例CYP2C9基因*1/*2的杂合突变(突变率0.005%)和 2例VKORC1 GG的野生纯合型(其G>A突变率98%),尽管民族上有一定差异,但红河少数民族居民在上述两个基因表型上,与东亚人群并无太大差别,与以往对我国人群的研究结论一致[16,17]。从结果中可以看出:尽管汉族人群中的VKORC1-1639 AA纯合突变率要高于红河彝族人群,而考虑到每个患者做为一个完整个体,是无法把这两个代谢相关基因表型的差异对华法林维持剂量的影响作用分开来进行评价,所以通过箱式图分布得到进一步的验证,CYP2C9*1/*1+VKORC1 AA的主要基因分型,AWD值总体均分布在2.0～3.0mg/d,但2组人群比较无显著差异。这一现象说明:仅靠华法林代谢基因CYP2C9和VKORC1多态性的单一遗传因素并不能准确预测华法林的实际剂量。

3.2 华法林代谢的影响因素

红河州彝族合并高血压、冠心病及术后心功能3级(NYHA分级)患者要低于汉族人群,此因素也可能会对华法林的代谢造成不同影响;与Qian等[18]研究红河少数民族人群的基因分布情况的结论相一致,需根据多重线性回归等方式对相应少数民族人群的因素进行多元分析,构建相应的华法林剂量预测公式,才能让华法林抗凝治疗能够更精准地应用于上述少数民族人群。值得注意的是:入组的病例均为无出血或栓塞不良事件的稳定剂量患者,而红河州彝族患者INR值波动在:1.76±0.45～1.95±1.04,低于汉族人群2.28±0.45～2.64±0.67(P<0.001),INR值维持在2.0～3.0时,接受华法林抗凝治疗的患者不易发生出血、栓塞等严重并发症[19],是否可以推测:红河州彝族居民接受抗凝治疗时,若增加华法林口服剂量,使其INR值达到汉族人群的水平,是否会出现出血的严重并发症,这值得笔者在后续工作深入研究。

本研究提示:高原地区居民长期处于低氧环境,存在凝血功能激活状态,当创伤、手术等应激作用后,血小板及凝血因子的大量消耗,可导致机体处于低凝状态,出血风险增加[20,21]。云南省红河哈尼族彝族自治州地形以山区为主(占85%),平均海拔高度在1300～1600m左右,属于典型的亚高原地区,具有高原地区的低气压、缺氧和高紫外线辐射等特点[22,23]。因而,在分析红河州居民华法林维持剂量的影响因素时,是否也需要把亚高原地区作为影响因素进行分析,是下一阶段笔者所要考虑的一个问题。

综上所述,红河彝族人群以CYP2C9*1/*1野生纯合型及VKORC1-1639 AA突变纯合的基因型为主,与东亚人群无明显差别;AWD值总体分布在2.0～3.0mg/d,虽然彝族VKORC1-1639 AA纯合突变率低于汉族人群;仅靠CYP2C9和VKORC1代谢相关基因的遗传多态性并不能准确估算华法林的实际剂量,针对彝族人群基因多态性、体表面积、合并疾病及环境等多因素等建立精准的华法林剂量预测模型,值得本文在后续研究中深入讨论。