HPLC法考察不同影响因素下雪诺同黄体酮阴道缓释凝胶的体外药物释放度

宋 歌,梅兴国,陈振雄

(1.湖北科技学院医学部药学院,湖北 咸宁 437100;2.军事医学科学院毒物药物研究所;3.咸宁市第一人民医院)

黄体酮,又名孕酮激素、黄体激素,是卵巢分泌的具有生物活性的主要孕激素,分子式为C21H30O2,对子宫内膜有显著形态学影响,是维持妊娠的关键物质,它能够保护女性的子宫内膜,给胎儿早期的生长和发育提供支持和保障[1-2]。近年来,出现了很多关于黄体酮给药的各种剂型的相关研究,我国的黄体酮剂型以胶囊剂、油剂和凝胶剂为主。目前已上市的凝胶剂型只有英国Serono Pharmaceuticals Limited生产的一种孕激素类药制剂Crinone®(中文名:雪诺同),据国外文献描述,雪诺同和口服剂型、注射剂型的黄体酮在黄体支持期相比,药效几乎等同,超过半成的受访者表示凝胶剂型耐受性良好,安全性更高[3-4]。

孕酮阴道凝胶是一种生物胶,含有细粉(微粉化)形式的孕酮以促进人体吸收。黄体酮阴道缓释凝胶不同于普通的凝胶制剂,普通的凝胶制剂在阴道内给药只能滞留数小时,而缓释凝胶则是一种乳白色的生物粘附性凝胶,具有释药缓慢、滞留时间久、刺激性小等优点[5]。它含有高分子仿生粘蛋白聚合物聚卡波非和卡波姆974p,聚卡波菲(Polycarbophil)可存在于阴道中长达72h之久并维持阴道酸性环境,因此,该凝胶是一种能够持续释药的系统[6]。

本研究所用供试品为Crinone®阴道缓释凝胶(8%),它由油相和水相混合而成,其油相为甘油、液状石蜡、氢化棕榈油甘油酯和黄体酮,其水相为纯化水、微量山梨酸、聚卡波非、卡波姆974p。聚卡波非和卡波姆974p主要作为载体赋形剂使其成为水包油型乳剂,黄体酮呈部分溶解、部分混悬状[7-9]。

本文从滤膜孔径、滤膜材质和释放介质3个因素入手,考察雪诺同的药物体外累计释放度,筛选出最优实验方案,以期为此类半固体型制剂的体外释放实验提供一定的参考。

1 材料与方法

1.1 仪器、试剂与试药

释放度试验仪(厂家:黄海药检;型号:RCZ-6B3;编号:PDA004)、电子天平(厂家:赛多利斯;型号:BP221S;编号:CAB003)、电子天平(厂家:瑞士梅特勒-托利多;型号:XSE105;编号:CAB002)、高效液相色谱仪(厂家:SHIMADZU;型号:LC-20A,编号:7-LC-20A-2)。

对照品:黄体酮标准品(厂家:中国食品药品检定研究所;批号:100027-201209;ID:M9L7-WEGS;含量:99.7%);供试品:Crinone®黄体酮阴道缓释凝胶(厂家:Serono Pharmaceuticals Limited;批号:C18107Y;规格:90mg,含量:8%);甲醇分析纯(厂家:国药集团化学试剂有限公司,纯度:99.5%);甲醇色谱纯(厂家:西陇试剂;纯度:≥99.9%);十二烷基硫酸钠(厂家:西安天正药用辅料有限公司;纯度:99.0%);实验用水:娃哈哈牌纯净水。

释放度实验所用样品架为本实验室自制的聚四氟乙烯样品架,外径为27mm左右,内径为22mm左右。释放用微孔滤膜分别来自英国Whatman公司提供的径迹蚀刻聚碳酸酯滤膜(PC膜)和尼龙滤膜、北京索莱宝科技有限公司提供的透析袋。

1.2 实验方法

体外释放度实验参考中国药典2020年版四部通则0931项下溶出度与释放度测定方法第一法(篮法)进行测定[10]。利用正交实验考察不同材质、不同孔径的微孔滤膜以及不同释放介质对黄体酮阴道缓释凝胶在4、12、24、36、48和72h的累计释放率的影响[11]。

1.2.1 对照溶液的制备

取黄体酮对照品4mg精密称定。置100mL量瓶中,加甲醇适量使溶解,并用甲醇稀释至刻度,摇匀,精密量取上述溶液10mL置50mL量瓶中,加水稀释至刻度,摇匀,作为对照溶液。以20%的甲醇溶液作为空白对照。利用高效液相色谱仪进行色谱测定,按外标法以峰面积计算。

1.2.2 供试溶液的制备

取滤膜1片,用镊子将其放在自制的聚四氟乙烯样品架上(如图1),使活性层朝上。精密称取三份100mg供试品,分别均匀涂抹于3个自制样品架上的膜中心(样品涂抹面积约为释放膜面积的1/3),以篮法测定[12]。将样品架浸入释放介质液面下1cm左右(如图1)。释放条件:释放介质体积:1000mL、转速:100r/min、水温:(37±0.5)℃;于4、12、24、36、48和72h,各取出5mL释放液,并补充相同体积的释放介质,经0.45μm的过滤膜过滤后,吸取20μL续滤液进入高效液相色谱仪,待测。按外标法以峰面积计算其在不同时间的累计释放率[13]。

图1 自制样品架示意图

1.2.3 色谱条件

a.色谱柱:十八烷基硅烷键合硅胶;b.流动相:甲醇-水(75∶25);c.流速:1mL/min;d.检测波长:254nm;e.柱温:40℃;f.进样量:20μL。

1.2.4 药物体外释放率计算公式

雪诺同中黄体酮的累计体外释放率按公式[14-15]计算:

式中:LCn%-表示累积释放率,单位为%;LC-表示标示量,单位为mg;V-表示取样体积,单位为mL;1000-表示释放介质体积,单位为mL;N-取样次数;Cn-取样点n时的药物浓度,单位为mg/mL;Ci-取样点i时的药物浓度,单位为mg/mL。

1.3 正交实验方法

根据实验条件,设计三因素三水平表,3个因素分别为滤膜材质(因子A)、滤膜孔径(因子B)和释放介质(因子C),每个因子设置3个水平,见表1。

表1 三因素三水平表

将3个因素各取3个水平进行排列组合,设计九组实验,绘制正交实验表格,见表2。根据正交实验表,开展实验1～9,以筛选最佳实验方案,考察不同材质、不同孔径的滤膜以及不同成分的释放介质对黄体酮阴道缓释凝胶药物体外释放度的影响。

表2 正交实验表

2 结 果

2.1 色谱结果

根据“1.2.3”项下色谱条件,将空白对照溶液、黄体酮对照溶液和黄体酮凝胶在4、12、24、36、48和72h的供试溶液分别进样,对照溶液的峰面积分别为319715、322125,峰面积的RSD值为0.53%,精密度良好。根据图2～4可知,该色谱条件下的检验方法专属性良好。

图2 空白对照溶液色谱图

图3 黄体酮对照品溶液色谱图

2.2 正交实验结果

将正交实验1～9的色谱测定结果分别代入“1.2.4”项下药物体外释放率计算公式中,得到不同因素水平下的药物累计释放率,见表3。根据正交实验结果,绘制极差分析表,见表4。根据表4可知,对试验结果影响最大的因素为因子A(滤膜材质)。最佳因素组合为:因子A(滤膜材质)为聚碳酸酯膜、因子B(滤膜孔径)为0.05μm、因子C(释放介质)为0.5%十二烷基硫酸钠磷酸缓冲盐溶液。因素主次顺序:因子A(滤膜材质)>因子C(释放介质)>因子B(滤膜孔径)。

表3 正交实验结果

表4 极差分析表

2.3 药物累计释放率曲线

通过对实验结果进行辩证分析,绘制了不同孔径滤膜、不同材质滤膜和不同释放介质3个影响因素下的黄体酮累计释放率曲线,见图5～7。根据图5可知,当滤膜孔径发生改变,而滤膜材质、释放介质等其他条件不变时,对药物累计释放率影响较小,滤膜孔径为0.05μm时的药物累计释放率稍高。根据图6可知,当滤膜材质发生改变,而滤膜的孔径、释放介质等其他条件不变时,对药物累计释放率的影响较大。当滤膜材质为聚碳酸酯(PC)膜时的药物累计释放率最高,当材质为透析袋时药物释放率近乎为零,因此,滤膜材质对药物释放度的影响较为明显。根据图7可知,当释放介质发生改变而其他条件不变时,对药物累计释放度影响较小,当释放介质为20%甲醇溶液时药物释放效果更佳。

图5 不同孔径滤膜条件下黄体酮的累计释放率曲线

图6 不同材质滤膜条件下黄体酮的累计释放率曲线

图7 不同释放介质条件下黄体酮的累计释放率曲线

3 讨 论

聚碳酸酯滤膜是在超净条件下,采用先进电介质技术制成的无菌膜,它包含均一的圆柱型小孔,膜表面光滑且平整,对提取物几乎没有吸附,便于对截留物粒子进行观察。主要特性为:孔径精确、流速快;低灰分和皮重;低蛋白吸附力、低水平反吸附,样品不易被污染;具有生物惰性和良好的耐化学性和热稳定性,适用于大多样品[16]。

尼龙滤膜是一种常见的滤膜材料,它具有优异的物理和化学性质,广泛应用于过滤、分离、纯化等领域。其主要特性为:亲水性好,无需润湿剂,润湿剂在过滤水溶液时会被萃取;柔韧性好、耐用、抗撕扯,能在135℃下高温灭菌;耐适当浓度的酸碱,不仅适用于含有酸碱性的水溶液,亦适用于过滤大多数有机溶液[17]。

透析袋通常是由半透膜制成的袋状容器,在生物大分子的制备过程中,除去盐、少量有机溶剂、生物小分子杂质和浓缩样品时都要用到透析技术。透析袋的主要特性为:透析动力来自扩散压,扩散压由横跨膜两边的浓度梯度形成;透析的速度反比于膜的厚度,正比于欲透析的小分子溶质在膜内外两边的浓度梯度,且正比于膜的面积和温度;透析温度通常为4℃,当温度升高可加快透析速度。但是,半透膜制成的透析袋可能存在透析时间长、样品回收率不高和无法处理微量样品的缺点[18]。

在进行药物体外释放试验时,观察到以下实验现象:尼龙膜上的凝胶大多与反渗介质一起形成混悬状态,而PC膜上的凝胶大多吸附在膜表面,少许与反渗介质混悬;尼龙膜于药物释放8h后出现明显的反渗现象,PC膜该现象则不明显;当释放介质为0.5%十二烷基硫酸钠磷酸盐缓冲溶液时,滤膜与释放介质接触面容易出现气泡,因此在进行释放实验前,需确保释放介质内的气泡充分排出[19-20];药物释放12h后9组实验的释放介质液面均下降明显(约下降0.4cm)。考虑到释放介质为有机溶剂,易挥发,在后期试验中用保鲜膜充分密封杯口[21],效果显著,有效防止了释放介质的挥发。

依据当前的黄体酮阴道缓释凝胶进口药物注册标准,要求黄体酮阴道缓释凝胶在4、24与72h的平均释放量分别成为标示量的15%～30%、35%以上与70%以上[22]。通过实验发现,使用尼龙材质微孔滤膜时药物4、24、72h的累计释放度均未达到该方法规定的要求,且在使用0.5%十二烷基硫酸钠磷酸盐缓冲液后其72h释放度仍只有54.82%。而使用相同孔径的聚碳酸酯纤维滤膜,以0.5%十二烷基硫酸钠磷酸盐缓冲液作为释放介质时,黄体酮24h累计释放率>35%,72h累计释放率可达80%,药物释放效果更佳。根据正交实验极差分析结果可知,滤膜材质对药物释放速率有明显影响,极差值(R)=74.88,影响因素主次顺序为因子A(滤膜材质)>因子C(释放介质)>因子B(滤膜孔径)。因此,选择孔径为0.05μm的聚碳酸酯膜作为释放滤膜以及0.5%十二烷基硫酸钠磷酸盐缓冲液作为释放介质时,可获得较理想的实验结果。