Leptin 循环水平与结直肠腺瘤及结直肠癌的关联性：一项病例对照和孟德尔随机化研究

赵欢灵，凌羽晓，宓 帅，朱家豪，范佳耀，杨 叶，王 晶，李迎君

1杭州医学院公共卫生系流行病与卫生统计学教研室，浙江 杭州 310053；2宁波大学医学院公共卫生学院，浙江 宁波 315211；3德清县莫干山镇卫生院，浙江 德清 313200；4浙江大学医学院公共卫生学院大数据健康科学系，浙江 杭州310058

结直肠癌是临床常见的恶性肿瘤之一，据国际癌症研究机构估计，其发病率和死亡率均居前3位［1］。结直肠癌的发病机制尚未完全阐明，研究表明遗传和环境因素在结直肠癌的发病中起主要作用。其中，环境危险因素主要包括肥胖、饮酒、吸烟以及不良的饮食习惯等［2］。大多数结直肠癌患者经“正常-腺瘤-腺癌”的途径发展而来［3］。早期结直肠腺瘤的切除能有效地降低结直肠癌的发生［4］。因此积极诊治结直肠腺瘤对结直肠癌的早期预防至关重要。

Leptin，一种由167个氨基酸组成的非糖基化蛋白质，通过与LEPR受体结合对能量稳态、葡萄糖稳态、免疫反应等起着重要的调控作用［5,6］。Leptin作为最丰富的脂肪因子之一，其对癌症的作用受到广泛关注［7-14］。然而，当前关于Leptin与结直肠腺瘤和结直肠癌发展的研究有限，且结果存在争议。一项研究用免疫组织化法检测到Leptin 在正常-腺瘤-腺癌序列中的表达逐渐升高［15］。另一项纳入6246例结直肠癌病例和7714例对照的研究发现，Leptin 基因位点rs2167270 和rs4731426与女性患结直肠癌的风险显著相关［16］。而研究显示Leptin 表达与淋巴结分期呈负相关，更高的Leptin水平可能提示更好的预后状况［17］。另外，部分研究则未发现Leptin与结直肠腺瘤或结直肠癌之间的关联［18-21］。这些证据提示Leptin极可能与结直肠腺瘤和结直肠癌的发生发展相关。由于既往传统的观察性研究结果参差不齐，未考虑Leptin与个体特征、饮食习惯以及生活方式等环境因素的关联，其结果可能存在混杂偏倚或反向因果偏倚，故需要进一步阐明Leptin与结直肠腺瘤及结直肠癌之间的关联［22］。孟德尔随机化（MR）研究是一种用于因果推理的流行病学研究方法，其利用与暴露相关的遗传变异作为工具变量来探讨暴露与疾病之间的因果关系［23］，由于遵循亲代的等位基因随机分配给子代的孟德尔随机化分配定律，遗传关联不易受到混杂因素或反向因果的干扰，被称为“大自然的随机对照试验”。

因此，本研究首次利用全基因组关联研究（GWAS）数据，结合开展病例对照研究和孟德尔随机化研究，旨在探讨血清Leptin水平与结直肠腺瘤，结直肠癌和结直肠腺瘤进展为结直肠癌之间有无潜在的因果关联。

1 资料和方法

1.1 研究对象

本研究以浙江大学医学院附属第一医院、浙江省肿瘤医院、浙江省诸暨市人民医院及杭州市临安区第一人民医院为研究现场，共纳入2018年～2020年的结直肠腺瘤患者497例，2014年～2019年的结直肠癌患者955例以及于医院体检的健康对照911例。结直肠癌病例按ICD9 153、154编码纳入，排除确诊为结直肠癌以外的其他恶性肿瘤和难以合作或资料不全者。结直肠腺瘤及结直肠癌均经手术或结肠镜确诊。本研究经杭州医学院伦理委员会审查批准（编号：LL2017-001），所有受试者在参加研究前均已签署知情同意书。

1.2 一般资料及标本采集

通过现场访问研究对象，收集以下信息：①社会人口学信息：性别，年龄，身高，体质量，婚姻，职业，家族史等；②生活方式因素：吸烟、饮酒史等。③疾病与健康状况：高血压、糖尿病等。现场采集受试者的外周静脉血5 mL置于真空抗凝采血管中，并在12 h内离分离血清，白细胞和红细胞，分别储存在-80 ℃冰箱。

1.3 血清Leptin水平测定

采用人血清Leptin ELISA 试剂盒（BioVision，USA）通过酶联免疫法测定血清Leptin水平。根据试剂盒说明，Leptin的检测范围为2～400 pg/mL。批内变异系数小于12%，批间变异系数小于10%。全部样本重复测量3次，并取均值进行分析。

1.4 遗传变异位点的选择

Leptin的工具变量来自一项包含23项独立研究的大规模Leptin GWAS数据，共纳入32 161例欧洲人群样本。对Leptin的工具变量做如下筛选：SNPs与Leptin显著关联（P＜5×10-8）；在中国人群中最小等位基因频率（MAF）大于0.1（基于1000 Genomes Project中中国汉族人群CHB的基因SNPs数据）；去除连锁不平衡（R2＜0.01，5000 kb），确保SNPs的独立性。为增强工具变量的解释效力，候选SNP rs6738627（P＜1×10-5）也被纳入。最后识别出5 个SNPs 作为Leptin 的工具变量：rs10487505、rs780093、rs900400、rs6071166、rs8043757（表1）［23］。在反向孟德尔随机化研究中，从GWAS数据中获取了101个与结直肠癌关联的SNPs，并基于上述条件进行进一步筛选，最后纳入63个与结直肠癌显著相关的SNPs（P＜5×10-8）作为结直肠癌的工具变量［24］。

表1 Leptin工具变量的基本信息Tab.1 Basic information of the instrumental variables associated with leptin

1.5 DNA提取和基因分型检测

采用磁珠核酸提取仪及全基因组DNA提取试剂盒（天根生化DP329），提取基因组DNA，使用NanoDrop 2000核酸定量仪（Thermo）测其浓度与纯度。提取的DNA浓度（＞50 ng/μL）和纯度（260/280比值在1.7～1.9）被认为符合实验要求。采用高通量Sequenom MassArray多重PCR检测技术，对5个SNPs进行基因分型检测，并采取盲法处理。10%的样本重复检测用于质量控制，检测一致性为100%。

1.6 统计学分析

1.6.1 病例对照研究 正态分布的计量资料以均数±标准差表示，非正态分布的计量资料表示为中位数（四分位距[IQR]），分类资料用例数和百分比表示。按对照组中血清Leptin分布的四分位数（Q1：＜0.430 ng/mL；Q2：0.430～0.507 ng/mL；Q3：0.508～0.631 ng/mL：Q4：＞0.631 ng/mL）将Leptin转化为分类变量。通过方差分析及卡方检验，分析各变量在结直肠腺瘤组和结直肠癌组以及健康对照组中分布的差异。采用单因素、多因素二分类Logistic回归模型分析经性别、年龄、家族肿瘤史、BMI、婚姻状况、职业类型、吸烟和饮酒状况多因素矫正后，血清Leptin水平与结直肠腺瘤及结直肠癌的关联强度，并计算OR值和95%CI。此外，该研究还进一步按性别、年龄进行分层分析。

1.6.2 孟德尔随机化分析

1.6.2.1 单样本孟德尔随机化分析 采用PLINK软件构建遗传风险评分（GRS），作为血清Leptin的工具变量。未加权GRS 由SNPs 含有的风险等位基因数相加构成。加权GRS为每个SNP的β系数与风险等位基因数（0、1或2）的乘积之和。采用两阶段最小二乘法（2SLS）分析Leptin GRS与结直肠腺瘤及结直肠癌的因果关联。首先，在加性遗传模型下，线性回归分析GRS与对数转换的血清Leptin的关联强度，保存Leptin的预测值。随后将预测值作为自变量，对结直肠腺瘤及结直肠癌进行对数线性模型分析，并校正性别、年龄。它表示Leptin 的GRS每增加1分，患结直肠腺瘤或结直肠癌的风险差异。

1.6.2.1 两样本孟德尔随机化分析 基于UK Biobank公开的GWAS数据，获得5657例结直肠癌患者和372 016例对照的汇总数据［25］。在PhenoScanner数据库中检索5个SNPs，删除与潜在混杂因素和结局相关的SNPs（P＜1×10-5）。两样本孟德尔随机化分析采用逆方差加权法（IVW）作为主要研究方法，也采用了加权中位数法（WME），MR-Egger回归与MR多效性残差和以及异常值（MR-PRESSO）法进行补充分析。同时采用Cochran's Q检验和MR-Egger截距检验识别SNPs的异质性和多效性。此外，估算每个SNP的F统计量。F统计量＜10提示存在弱工具变量偏倚，而现有SNPs的F统计量均＞10。采用Stata SE（14.2）和R（3.1.4）进行统计分析，统计检验均为双侧，检验水准α=0.05，P＜0.05时认为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 病例对照研究结果

本研究共纳入结直肠腺瘤病例497例、结直肠癌病例955例、阴性对照911例。年龄、血清Leptin浓度、性别、BMI、婚姻状况、职业类型、家族肿瘤史及吸烟和饮酒状况在3组间的分布差异均有统计学意义（P＜0.001，表2）。单因素Logistic回归分析发现与最低四分数的leptin 水平相比，高浓度的leptin 与结直肠腺瘤风险呈正相关（OR=1.75，95%CI：1.27～2.43，P=0.001），与结直肠癌风险呈负相关（OR=0.55，95%CI：0.45～0.75，P＜0.001），与结直肠腺瘤患者进展为结直肠癌的风险呈负相关（OR=0.33，95%CI：0.24～0.45，P＜0.001，表3）。进一步经相关混杂因素调整后（模型2），多因素Logistic与单因素Logistic的回归结果保持一致（表3）。调整相关混杂因素后（模型2），性别分层分析发现男性的血清Leptin水平与结直肠腺瘤发生呈正相关，而女性中未发现此关联（表4）。在年龄分层分析显示，经性别、BMI、职业、家族肿瘤史、婚姻状况、吸烟及饮酒状况调整后，年龄＜50岁的组别中，血清Leptin水平与结直肠腺瘤，结直肠癌没有关联，而在年龄≥50岁的组别中，与最低四分数水平的Leptin相比，高浓度的Leptin水平与患结直肠腺瘤的风险增加相关，与患结直肠癌及结直肠腺瘤进展为结直肠癌的风险降低相关（表5）。

表2 病例组与对照组临床资料比较Tab.2 Clinical characteristics of the case group and control group

表3 血清Leptin水平与结直肠腺瘤及结直肠癌发生风险的病例对照研究Tab.3 Acase-control study of the relationship between serum leptin levels and the risks of colorectal adenoma and colorectal cancer

表4 血清Leptin水平与结直肠腺瘤及结直肠癌的性别分层分析Tab.4 Gender-stratified analysis of serum leptin levels with colorectal adenoma and colorectal cancer

表5 血清Leptin水平与结直肠腺瘤及结直肠癌的年龄分层分析Tab.5 Age-stratified analysis of serum leptin levels with colorectal adenoma and colorectal cancer

2.2 孟德尔随机化研究结果

未加权GRS与结直肠腺瘤、结直肠癌、结直肠腺瘤进展为结直肠癌的风险不存在因果关联（P＞0.05）。加权GRS与未加权GRS的结果一致，在调整了性别、年龄后，结果依旧保持一致（表6）。两样本孟德尔随机化研究与单样本孟德尔随机化研究的结果保持一致，发现Leptin与结直肠癌的风险无因果关联（P=0.957），反向孟德尔随机化分析也未发现结直肠癌与Leptin水平存在因果关联（P=0.396）。两样本孟德尔随机化研究中皆未发现异质性和多效性的存在。

表6 Leptin的GRS与结直肠腺瘤及结直肠癌的单样本孟德尔随机化研究Tab.6 One-sample Mendelian randomization analysis of leptin GRS with colorectal adenoma and colorectal cancer

表7 遗传预测的Leptin与结直肠癌的两样本孟德尔随机化研究Tab.7 Two-sample Mendelian randomization analysis of genetically predicted Leptin with colorectal cancer

3 讨论

本研究基于病例-病例-对照设计，同时构建Leptin GRS，进行病例对照研究和孟德尔随机化研究，探讨了Leptin与结直肠腺瘤、结直肠癌及结直肠腺瘤进展为结直肠癌的风险之间的关联。病例对照研究结果显示高浓度的Leptin循环水平与结直肠腺瘤风险呈正相关，而与结直肠癌风险呈负相关，也与结直肠腺瘤患者进展为结直肠癌的风险呈负相关。但孟德尔随机化研究并未发现Leptin与结直肠腺瘤，结直肠癌以及结直肠腺瘤进展为结直肠癌风险的因果关联。

Leptin作为最重要的脂肪因子之一，在调节能量代谢、内分泌和免疫系统中发挥着重要的作用。目前，关于Leptin对癌症影响的研究，结果存在争议［26］。研究显示，Leptin 可通过激活PI3K/AKT/mTOR［27,28］，Nrf2-Sirt1［29］，ERK1/2［30-32］，MAPK［31-33］，JAK2，STAT3，AP-1［34,35］，NF-κB［36］等信号通路直接诱导结直肠癌细胞的增殖、凋亡或侵袭。此外，Leptin还可激活IL-6、IL-1β和趋化因子CXCL1 促进炎症反应［37］，进而促进癌症的发生。Leptin还可以刺激结肠的癌前上皮细胞中血管内皮生长因子的表达，从而促进血管的生成和发育［38］。然而，另一项研究发现高表达的Leptin提示结直肠患者更佳的预后情况［15］。此外，在T细胞免疫受损的小鼠中发现Leptin 可以调节细胞免疫并逆转饥饿引起的免疫抑制［39］，而增强免疫可以进一步抑制肿瘤的发生［40］。

目前，关于Leptin循环水平与结直肠腺瘤及结直肠癌发病风险的关联研究十分有限，且结果存在争议。一项横断面研究发现，高水平的血清Leptin与患结直肠腺瘤的风险升高相关［41］。一项病例对照研究显示，Leptin升高与结直肠腺瘤的发病风险呈正相关［19］。研究发现结直肠癌患者的血清Leptin水平明显低于对照组［42,43］。此外，另一项病例对照研究表明Leptin与结直肠癌风险呈负相关［44］，这与本研究的结果一致。而有研究未发现血清Leptin与结直肠癌相关［45,46］。一项基于1129例结直肠癌患者和1129例对照的前瞻性巢式病例对照研究发现LEPR与结直肠癌风险相关，而未发现Leptin与结直肠癌风险的关联［47］。一项源自欧洲人群的巢式病例对照研究也未发现Leptin与结直肠癌风险有关［18］。此外，一项包含了3614例结直肠癌患者，1215例结直肠腺瘤患者，5220例对照的荟萃分析表明血清Leptin与结直肠腺瘤的风险呈正相关而与结直肠癌无关［20］。两项荟萃分析结果显示，Leptin水平与结直肠癌风险不存在关联［21,48］。以上研究与本研究不一致，可能是由于样本量参差不齐、流行病学研究的设计差异、混杂偏倚、反向因果偏倚以及种族差异等因素导致的。

关于分层分析，此研究发现，男性血清Leptin的浓度与结直肠腺瘤发病存在正相关，但在女性中未发现，符合研究现状［3,49］。研究发现，雄激素水平可以调节肠道上皮干细胞的再生［50］，这可能是男性结直肠肿瘤高发的原因之一。年龄分层分析显示随着年龄的增长，高水平Leptin与结直肠腺瘤及结直肠癌的关联更加显著。研究显示，年龄与结直肠癌发生风险成正相关，≥50岁时结直肠腺瘤和结直肠癌的发生风险显著升高［49,51］。随着年龄增长，免疫力降低，抑癌基因衰老，细胞衰老等因素增加了患癌症的机率［52］。

目前缺乏Leptin遗传变异与结直肠腺瘤发生风险的相关研究。关于Leptin遗传变异与结直肠癌的关联研究，目前多数研究与本研究结果保持一致。有研究在伊朗人群中未发现LEPR基因Gln223Arg多态性与结直肠癌发病风险有关［53］。另一研究也未发现Leptin rs7799039和LEPR rs1137101与结直肠癌风险之间的关联［54］。一项基于GWAS数据的两样本孟德尔随机化研究也提示一些脂肪因子，例如脂联素、Leptin等，与肥胖相关癌症未发现存在因果关联［55］。以上研究提示Leptin与结直肠癌的关联可能不是因果关联。而一项包括了1 003结直肠癌病例和1 303对照的病例对照研究显示，LEPR rs6588147可降低患结直肠癌的风险［56］。然而目前尚缺乏LEPR rs6588147与癌症的关联研究且该位点的功能尚未知晓，LEPR rs6588147可能具有基因多效性从而导致结果偏倚。

传统的病例对照研究和孟德尔随机化研究的结果不一致可能有以下原因，病例对照研究往往是患有结直肠腺瘤或结直肠癌在前，检测Leptin水平在后，可能存在反向因果偏倚。此外，对于孟德尔随机化研究，Leptin的SNPs能解释的遗传变异仅占Leptin变异中的小部分，在发现弱因果关联效应时其把握度相对较低。Leptin与肥胖密切相关，肥胖作为结直肠腺瘤及结直肠癌发生的独立危险因素，Leptin可能通过作用于肥胖进而影响结直肠腺瘤及结直肠癌。Leptin的SNPs来自欧洲人群GWAS，尚不清楚Leptin的SNPs是否因种族而异。尽管该研究采用加权中位数法，MR-PRESSO和MR-Egger回归等方法，并在PhenoScanner数据库中剔除了与混杂因素相关的SNPs，然而，由于基因功能的复杂性，SNPs与其他未知因素可能存在关联，从而导致基因多效性，使得孟德尔随机化研究结果出现偏倚。

该研究具有如下优势，首先整合了GWAS中识别的多个Leptin相关SNPs，从而生成强于任何单一SNP的GRS。此外，孟德尔随机分析可以有效地避免传统观察性流行病学研究中混杂因素、反向因果等偏倚。但该研究也存在一定的局限性。首先，饮食习惯资料的缺乏，因此无法深入研究Leptin与饮食习惯和结直肠癌之间的关联。其次，由于基因功能的复杂性，可能与其他未知因素相关，造成基因多效性，使得孟德尔随机化研究结果出现偏倚。再者，统计能力不足是单样本孟德尔随机化分析中普遍存在的局限，所以对于零结果的解释不能排除Ⅱ型错误［57］。此外，当前研究的Leptin相关SNPs个数较少，且基于欧洲人群，可能会存在种族间、地域间差异。尽管存在上述局限，孟德尔随机化方法仍然是评估假定风险因素和疾病关联的有效手段。因此，未来需要在东亚人群中基于更有力的Leptin遗传变异和大样本结直肠腺瘤及结直肠癌的数据，进一步展开孟德尔随机化研究。

综上所述，病例对照研究提示Leptin循环水平与结直肠腺瘤、结直肠癌及结直肠腺瘤进展为结直肠癌存在关联，但孟德尔随机化研究未发现leptin 与结直肠腺瘤、结直肠癌及结直肠腺瘤进展为结直肠癌的风险存在因果关联。仍有待更多研究来验证本研究结果。