紫草素联合半导体激光预防釉质脱矿的体外研究

范文献, 范译丹, 赵 今, 李新尚

(新疆医科大学第一附属医院(附属口腔医院)1牙体牙髓科, 2口腔修复科, 3口腔急诊综合科, 乌鲁木齐 830054)

龋病是一种常见的慢性进行性的炎症感染性口腔疾病,根据第四次全国口腔健康流行病学调查报告显示,12岁以下儿童恒牙龋患率为34.5%,5岁一下儿童乳牙龋患率为70.9%[1]。龋病是由于牙釉质表面脱矿,钙、磷酸根离子在酸性作用下从牙釉质中溶解,导致牙釉质脱矿[2]。通常氟化物中的氟离子取代牙齿表面的羟基形成溶解度更低的氟磷灰石,大大降低了龋齿患病率。氟化物大量的应用也提高了氟斑牙和氟骨症的发病率[3]。含氟产品仍不足以解决易感人群的患龋风险,因此寻找一种可替代的预防手段成为目前研究的热点。紫草素(Shikonin)是紫草中一种萘醌类化合物,已被广泛用于食品及化妆品的着色剂,临床多用于肝炎、扁平疣以及烧伤的治疗[4-6]。本课题组前期研究发现紫草素对口腔致龋细菌及其生物膜的生长、产酸、产糖以及黏附等致龋毒力因子有明显抑制的作用[7]。目前临床上多采用激光治疗龋病,具有安全快捷、快速有效的特点,深受临床推崇。半导体激光器是一种小巧便携的激光器,易于应用,成本较低,产生的热量较少,且不会对搪瓷表面造成热损伤。本研究采用人牙釉质块模型探究半导体激光联合紫草素的无创防龋效果,现报道如下。

1 材料与方法

1.1 试药紫草素(上海源叶生物科技公司,批号517-89-5),再矿化液(北京索莱宝科技有限公司,批号A8990),溴麝香草酚(北京索莱宝科技有限公司,批号T8690),磷酸盐缓冲液(上海通蔚实业有限公司,批号TW25181),磷酸二氢钾(天津市大茂化学试剂厂,批号3190),硝酸钙(天津市大茂化学试剂厂,批号3189),乙酸(天津市大茂化学试剂厂, 批号3139),氢氧化钠(天津市大茂化学试剂厂,批号3197),氟化钠(NaF,天津市大茂化学试剂厂,批号4399)。

1.2 仪器低速金刚石锯(长沙众邦医疗器械有限公司),HTV-PHS30显微维氏硬度计(北京聚瑞众邦科技有限公司),Dimension icon XR原子力显微镜(德国布鲁克公司),ESCALAB 250Xi -X射线能谱仪(美国赛默飞世尔科技公司),JSM-6390LV扫描电子显微镜(日本电子株式会社,),XS1003S电子天平(瑞士梅特勒-托利多公司),PHS-3B型pH计(上海雷磁仪器厂),HH.S11-1水浴锅(上海博迅科技有限公司)。

1.3 溶液的配制(1)0.1%溴麝香草酚溶液:取1 g溴麝香草酚用1 mL无水乙醇溶解后,加入1 000 mL的无菌蒸馏水,配制成 0.1%的溴麝香草酚溶液。(2)磷酸盐缓冲液:取0.2 mol/L磷酸二氢钾溶液250 mL,0.2 mol/L氢氧化钠溶液18 mL加入1 000 mL的烧瓶中,用去离子水稀释至刻度,摇匀即得。(3)脱矿液:取2.2 mmol/L硝酸钙0.26 g、2.2 mmol/L磷酸二氢钾0.15 g、50 mmol/L乙酸1.5 g,加入1 000 mL的烧瓶中,用去离子水稀释至1 000 mL,氢氧化钠调节pH=4.8,摇匀即得。(4)紫草素母液:用电子天平秤称取紫草素32 mg,溶于1 mL的二甲基亚砜(Dimethyl sulfoxide,DMSO)中,即得浓度为32 mg/mL的紫草素母液,于-80℃冰箱中储存,备用。(5)取5 g氟化钠用100 mL去离子水溶解,配制成5%的氟化钠溶液。

1.4 离体牙的收集收集2021年12月-2022年7月在新疆医科大学第一附属医院(附属口腔医院)就诊的15～20岁因正畸减数拔牙的新鲜前磨牙或第三磨牙,术前片显示根尖孔发育完全、冠根均无龋、无裂纹、无氟斑牙、无四环素牙、无牙釉质发育不全或矿化不全,按照以上标准共收集标本180颗。去除牙釉质表面结石和菌斑,超声清洗30 min,备用。

1.5 样本制备将90颗牙自然晾干,石蜡包埋后用低速金刚石锯切割成5 mm×5mm×3mm 釉质块,在蒸馏水下依次用800、1 200、2 400目碳化硅砂纸磨平抛光釉质面,磨除厚度0.1 mm,用碳铅笔在样本釉质面画出一个水平矩形区域(3 mm×3 mm)作为暴露窗口,其余部分涂布2层抗酸指甲油,用去离子水冲洗后存于0.1%溴麝香草酚溶液中备用。

1.6 脱矿流程将“1.5”项下制备的釉质样本随机分为6组:对照组、紫草素组、激光组、NaF组、激光联合NaF组、激光联合紫草素组,每组15个样品。将各组样品37℃下浸入15 mL脱矿液(pH=4.8)中脱矿72 h,100%湿度下连续培养3 d,每天更换脱矿液1次。

1.7 各组处理方法脱矿期间,对照组:不处理;紫草素组:用紫草素溶液处理样本实验区表面5 min(紫草素溶液32 mg/mL,小毛刷均匀涂布),干燥后用去离子水冲洗,每天2次;激光组:用激光照射样本实验区表面15 s(脉冲强度15 Hz,脉冲持续时间30 ms,光圈直径400 pm,照射距离5 mm,采用连续波模式),干燥后用去离子水冲洗,每天2次;激光+NaF组:同激光组处理方法,然后用5%NaF溶液处理样本实验区表面5 min,干燥后用去离子水冲洗,每天2次;NaF组:用5%NaF溶液处理样本实验区表面5 min,干燥后用去离子水冲洗,每天2次;激光+紫草素组:同激光组处理方法,然后用紫草素处理样本实验区表面5 min,干燥后用去离子水冲洗,每天2次。

1.8 指标测定

1.8.1 样本表面显微硬度的测量 每个样本脱矿前随机选取5个点施加50 g 的力持续10 s,采用维氏显微硬度计测量样本表面显微硬度,计算公式:VHN=F/A,其中:VHN为表面显微硬度,F为载荷(千克力),A为表面积(mm2),计算5个点的平均显微硬度为初始硬度值。脱矿实验完成后,同法测定脱矿后硬度值。比较各组脱矿前后样本表面显微硬度值,表面显微硬度值越高,表示样本表面脱矿越轻。

1.8.2 样本表面形貌、粗糙度(Rq , Ra)和脱矿深度(VD)的测量 采用原子力显微镜(AFM)在空气环境中进行测量,采用轻敲模式,针尖曲率半径为8 nm,力常数为40 N/m,共振频率331.179 kHz的硅探针,扫描范围为10 μm×10 μm,扫描频率为0.5 Hz。通过原子力显微镜分析软件NanoScope Analysis分析样品表面形貌、粗糙度(Rq , Ra)和脱矿深度(VD)。

1.8.3 样本表面的元素分析 将釉质样本用无水酒精进行脱水,安装在粘有非导电胶的观测台上,经干燥、真空条件镜下观察漂白后釉质样本表面的形态变化(电压 20 KV),在各组釉质样本上随机选择4个位点,分别在500、1 000、2 000、5 000 倍镜下拍摄图像。将各组釉质块进行能谱分析,计算分析各组釉质块中钙、磷元素含量,计算钙磷摩尔比,钙磷摩尔比越大表示脱矿越小。

2 结果

2.1 各组样本牙釉质脱矿前后表面显微硬度比较脱矿前各组样本牙釉质表面显微硬度差异无统计学意义(P>0.05)。与对照组、紫草素组、激光组比较,激光联合紫草素组显微硬度值增大,差异有统计学意义(P<0.05);与激光联合NaF组比较,激光联合紫草素组显微硬度值减小,差异有统计学意义(P<0.05);与NaF组比较,激光联合紫草素组显微硬度值差异无统计学意义(P>0.05),见表1。

表1 各组样本牙釉质脱矿前后表面显微硬度比较

2.2 各组脱矿后牙釉质表面粗糙度(Rq, Ra)、脱矿深度(VD)比较与对照组、紫草素组、激光组比较,激光联合紫草素组表面粗糙度和脱矿深度减小,差异有统计学意义(P<0.05);与激光联合NaF组比较,激光联合紫草素组表面粗糙度和脱矿深度增大,差异有统计学意义(P<0.05);与NaF组比较,激光联合紫草素组表面粗糙度和脱矿深度差异无统计学意义(P>0.05),见表2。

表2 各组脱矿后牙釉质块表面粗糙度,脱矿深度

2.3 各组脱矿后牙釉质块表面形貌情况通过原子力显微镜3D模型重建观察发现,对照组:样本表面高低起伏不平,有许多被酸侵蚀的凹陷,呈现出不规则的形态,峰很高,波谷很低,牙釉质表面釉柱完全暴露,柱间牙釉质完全溶解,釉柱间隙增大(见图1a)。紫草素组:样本表面高低起伏范围和程度较对照组有所减小,但是表面也有许多被酸侵蚀的凹陷呈现出不规则的形态,牙釉质表面釉柱暴露,柱间牙釉质基本溶解,釉柱间隙增大(见图1b)。激光组:样本表面高低起伏范围和程度较紫草组有所减小,表面也有被酸侵蚀的凹陷呈现出不规则的形态,牙釉质表面釉柱暴露,柱间牙釉质基本溶解,釉柱间隙增大(见图1c)。激光联合NaF组:样本表面光滑平坦,牙釉质表面釉柱轻微暴露(见图1d)。NaF组:样本表面较为光滑,表面地貌较为平坦,牙釉质表面釉柱轻微暴露(见图1e)。激光联合紫草素组:样本表面较为粗糙,表面地貌较为平坦,牙釉质表面釉柱轻微暴露有,在釉柱区域表现出轻微的矿物质损失(见图1f)。

注: a: 对照组, b: 紫草素组, c: 激光组, d: 激光联合NaF组, e: NaF组, f: 激光联合紫草素组。图1 各组脱矿后样本表面形貌3D模型图

2.4 各组脱矿后牙釉质块表面元素分析的比较与对照组比较,激光联合紫草素组表面钙磷元素摩尔比值增大,差异有统计学意义(P<0.05)。与激光联合NaF组、NaF组比较,激光联合紫草素组表面钙磷元素摩尔比值减小,差异有统计学意义(P<0.05);与激光组、紫草素组比较,激光联合紫草素组表面钙磷元素摩尔比值差异无统计学意义(P>0.05),见表3,图2。

表3 各组脱矿后牙釉质块表面钙磷摩尔比

注: a: 对照组, b: 紫草素组, c: 激光组, d: 激光联合NaF组, e: NaF组, f: 激光联合紫草素组。图2 各组脱矿后牙釉质块表面元素分析图

3 讨论

预防龋齿是现代口腔领域的主要目标之一,包括预防牙齿脱矿及促进其再矿化,处理方式不再是传统的去腐和填充,而是通过无创手段来达到这一目标[8]。再矿化是牙齿恢复矿物质的修复过程,通过唾液中的钙、磷酸盐和氟化物的交换而发生[9]。脱矿和再矿化之间的动态平衡始终保持在一个相对稳定的阶段,当细菌产酸攻击牙釉质时有可能打破这种平衡,导致釉质倾向于脱矿方向发展,最终导致龋损的形成[10-11]。氟化物在增强再矿化方面有着重要作用,局部应用氟化物是阻止或预防龋齿的有效方法[12]。氟离子可以取代羟基磷灰石中的羟基,导致氟磷灰石的形成,由于氟磷灰石在酸中的溶解度低于羟基磷灰石,因此在酸性环境下具有更高的抵抗力[13-14]。

紫草素(Shikonin)是从紫草(Lithospermumerythrorhizon,Onosmapaniculata或Arnebiaeuchroma)的干燥根中提取的一种活性成分,具有抗菌消炎,抗血管生成等活性[15-18],在触发活性氧的产生,抑制外泌体释放,诱导细胞凋亡方面起着至关重要的作用[19-22]。

研究表明当存在氟化物、钙或磷离子时,激光照射可以通过改变其化学形态结构促进再矿化过程,从而增强牙釉质的耐酸性[23]。加热牙釉质可以引起牙釉质的化学改变,增强抗龋齿能力。然而,光热相互作用通常伴随着对牙釉质表面的不利形态变化,例如裂纹。半导体激光器在羟基磷灰石中的吸收系数较低,能量多以热量的形式散射,对牙釉质表面的完整性没有损害[24]。此外,半导体激光器体积小,便于携带,易于应用且价格合理,这些优点使其成为预防龋齿的首选激光器。牙科应用的半导体激光器发射波长范围为800～1 064 nm[25]。在可见光谱内发出蓝光的445 nm半导体激光器已在临床广泛使用,其被色素组织和胶原蛋白吸收较高,是传统红外半导体激光器的10倍[26-27],且半导体激光照射可以增加人体牙釉质中氟化物的摄取[28]。

本研究表明,紫草素联合半导体激光处理的样本显微硬度较高,表面粗糙度和脱矿深度较小,表明紫草素联合半导体激光可以预防牙釉质脱矿,效果优于紫草素组。综上所述,半导体激光照射后联合紫草素可以明显提高预防脱矿的效果。